随着环境恶化、空气污染的加剧,肺部感染的患者逐年增多,特别是中老年和吸烟人群。糖皮质激素是肺部疾病临床常用药,具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒等作用,虽能有效缓解肺部炎症反应,但长期或大量使用会引发高血压、骨质疏松、糖尿病等副作用,故有必要开发更加安全的治疗药物或保健品。本文主要针对芹菜的抗炎平喘的药效基础和治咳川贝枇杷滴丸的治疗特色展开基础研究。芹菜（Apium graveolens L.）属伞形科芹属,一或二年生草本植物,原产于地中海沿岸的沼泽地带,目前世界各国已普遍栽培,种植面积广泛,栽培芹菜品种较多,如津南实芹、津南冬芹、文图拉、高犹它、意大利冬芹、玻璃脆、法国皇后等。我国芹菜栽培始于汉代,史载于《本草经》,至今已有2000多年的历史,在我国芹菜主要分为本芹、旱芹和根芹,三者功能相近,药用以旱芹为佳,我国现有栽培品以旱芹为主。芹菜性凉,味甘辛,主治高血压,头痛,头晕,糖尿病,黄疸,水肿等病症。主要成分有黄酮、苯酞、香豆素与豆甾醇类等,其中黄酮类含量在果蔬中较高,大量的生物活性研究表明芹菜黄酮具有抗氧化,抗炎,抗肿瘤等多种活性。目前关于芹菜的研究多集中在栽培管理和营养价值上,对日常保健和药用价值的研究较少。芹菜的现代饮食和食疗搭配多种多样,例如西芹百合的烹饪,芹菜及其他果蔬的混合饮品,芹菜面制品豆制品等,多数的研究功效旨在降血压调节血糖血脂,少数提及清热解毒、抗炎平喘的功效。本文主要对芹菜的的清咽润肺药理作用及机制,进一步研究并提供科学依据,为芹菜的开发利用提供理论基础。治咳川贝枇杷滴丸是天津中新药业第六中药厂研制的治疗哮喘及支气管炎并发症的唯一现代中药滴丸制剂,是依据中医药传统理论和现代制剂新技术结合的精华产物。治咳川贝枇杷滴丸主要由枇杷叶、平贝母、桔梗、水半夏、薄荷脑5味中药组成,具有宣肺降气、清热化痰的功效,临床上主要用于痰热郁肺所致咳嗽及支气管炎等症。大量的药理实验探究和临床观察,发现治咳川贝枇杷滴丸能有效地镇咳平喘祛痰,治疗咽炎及支气管炎等。但治疗支气管炎等肺部疾病的临床应用药物品种及剂型多样,治疗效果也层次不齐,虽然治咳川贝枇杷滴丸有较好的治疗作用,但是与临床常用抗炎平喘中成药的药效差异并未见报道。除此之外,但由于川贝母资源的匮乏,平贝母被收载于2015版中国药典作为贝母新基原应用于临床。目前对川贝母与平贝母差异性研究,仅限于单味药材在抗炎平喘等药理活性以及化学成分的研究,未涉及两者在治咳川贝枇杷滴丸制剂中的药效差异性,所以本文通过不同的药理模型比较川贝母与平贝母在药剂中的替换导致的药效学差异,为该药物的制剂制备提供更充分的数据基础,为指导临床针对性用药和市场销售提供了有力证据。1.芹菜的质量评价芹菜品种的大量引入不仅丰富了我国的饮食,同时芹菜栽培技术也发生了巨大的变化,培育出更多适合中国环境的芹菜品种,例如山东省章丘的鲍芹、马家沟的空心芹、天津津南实心芹等,产量与品质均有显著提高。不同品种的芹菜除了产量差异外,营养价值和有效药理成分也有所不同,故对收集到的5个芹菜样品的化学成分和抗氧化活性进行比较,利用HPLC和LC-MS等方法对其中4种多酚化合物和9种黄酮物质进行定性和定量,相关性分析和主成分分析结果表明木犀草苷、芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷等是抗氧化作用的主要活性化合物。通过总评分得出,5个芹菜品种主要聚类为3类,第一组津南实芹1号和章丘芹菜,两种芹菜在总酚酸、总黄酮、总氨基酸和阿魏酸,芹菜苷,3-甲氧基芹菜苷的含量比较接近,第二组香芹和文图拉芹,第三组为马家沟芹菜。根据主成分分析,津南实芹1号综合得分最高,为1.92,其次是章丘芹和马家沟芹,分别为1.41分和0.12分,香芹和文图拉芹得分较低,分别为-1.35和-2.10,说明芹菜品质有明显的地域和品种差异,为开发芹菜保健品或食品等的原料选择有指导意义。2.体外消化对芹菜成分及活性的影响消化过程是人体分解食物药物、影响吸收主要营养和有效成分的关键。由消化腺所分泌的各种消化液,将复杂的各种营养物质分解为肠壁可以吸收的简单化合物,这使其原来的性质发生变化,故以津南实芹1号为代表,模拟体外消化环境展开芹菜的消化研究。实验结果发现,总酚酸和总黄酮在口腔-胃-肠消化过程中,两者的释放规律是相似的。胃消化过程中酚类化合物的释放程度比口腔消化和S肠消化中的强,可能由于低p H或胃蛋白质酶的水解有利于酚类物质与糖、细胞壁多糖的分离而含量增加;肠消化后总酚酸含量降低,可能是由于高p H时多酚不稳定所致。总黄酮在胃蛋白酶和低p H的环境下能稳定存在,肠道消化液反而可以促进类黄酮的释放,但随时间变化,在p H值较高的肠道环境中,总黄酮也有不同程度的降解,导致含量增长缓慢。此外,木犀草苷、芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷的在整个消化过程中含量稳定增加,因胆汁等肠消化酶的作用,黄酮苷元木犀草素和芹菜素在肠消化中含量显著增加。通过DPPH、ABTS+和FRAP三种自由基清除活性实验测定抗氧化能力及相关性分析发现总酚酸（R²=0.744）和总黄酮（R²=0.678）与清除自由基的能力显著相关,说明酚类和黄酮化合物是芹菜叶抗氧化性能的主要影响因素,包括类黄酮和非类黄酮酚类化合物。比较木犀草苷、芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷、木犀草素、芹菜素与抗氧化活性的相关性的数值,其排列顺序为:木犀草素>芹菜素>木犀草苷>芹菜苷>3-甲氧基芹菜苷,可能由于糖苷键的断裂暴露出酚羟基,从而产生更高的抗氧化能力,甲基或糖基取代3-OH、3’-OH和4’-OH组会降低抗氧化活性,同时可能会影响与活性位点残基的有效结合,即芹菜的在消化过程中有化合物的转化,可能会使生物活性发生变化。根据芹菜的消化规律可以预测,含有黄酮类化合物的食品或中药,可能具有相似的消化模式,为人体对黄酮的消化吸收代谢提供了理论依据。3.芹菜的体外平喘及机制研究相关研究发现芹菜与其他果蔬等混合饮品有清热解毒,缓解哮喘的功效,但未曾报道平喘的可能机制。通过建立体外豚鼠离体气管收缩模型,发现消化后产物较消化前的物质更能有效的抵抗组胺、乙酰胆碱刺激产生的气管收缩,结果说明由于糖苷键的断裂而游离出的苷元木犀草素、芹菜素较糖苷类有平喘优势;此外,该消化产物能有效抑制外Ca²⁺导致的气管收缩。加入钙离子通道抑制剂预先孵育气管后,对由2μΜ组胺引起的气管收缩有显著性的影响,因此可知,钙离子通道与之引起的舒张效应相关。加入腺苷酸环化酶激活剂,可以通透细胞,激活腺苷酸环化酶从而升高细胞内的c AMP水平,4mg/ml的消化溶液显著左移其诱导的对数浓度舒张曲线,这表明消化产物可能通过作用于c AMP-c GMP-PDE通路途径而产生平喘作用。为了进一步确定黄酮化合物对磷酸二酯酶4型（PDE4）活性抑制的强弱,我们通过体外酶活实验分析了7种类黄酮化合物对磷酸二酯酶的抑制情况,7种类黄酮化合物的抑制活性排序为:槲皮素>木犀草素>山奈酚>芹菜素>圣草酚>柚皮素>漆黄素。同时结合计算机分子对接模型分析,黄酮与PDE4蛋白的结合主要集中在谷氨酰胺（Gln369）、苯丙氨酸（Phe372）和异亮氨酸（Ile336）等的残基上,其结合的距离远近、相互作用力的强弱会影响黄酮对磷酸二酯酶的抑制活性。槲皮素、木犀草素等黄酮醇类能显著抑制磷酸二酯酶的活性,即C3-OH对磷酸二酯酶的活性影响较大,此外,C3’-OH和C2=C3双键结构会影响黄酮与磷酸二酯酶的共轭作用。结果表明芹菜消化产物芹菜素及木犀草素能有效平喘,同时显示黄酮的特殊结构会影响其活性,提示在研究黄酮及其类似物时,应充分考虑其结构特点,更加明确影响活性的关键性元件,为进一步结构修饰提供理论基础。4.芹菜的体内抗炎抗氧化作用研究哮喘除引发咳嗽喘息等肺功能降低外,还会因炎症的浸润加剧哮喘的发展,故建立由脂多糖（LPS）引起的经典大鼠急性肺炎模型,体内评价芹菜黄酮对急性炎症和氧化应激损伤的保护作用。结果显示,芹菜黄酮不仅能抑制NF-κB炎症通路,减少炎症因子抗肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素1（IL-1β）的释放,抑制中性粒细胞的浸润和肺血管通透性变大和水肿,还能激活Nrf2抗氧化通路,提高超氧化物歧化酶,过氧化氢酶等抗氧化酶的活性,减少过氧化物的浸润,降低呼吸爆发引起的肺损伤。此外,体内也显著抑制了磷酸二酯酶4型的转录,其中木犀草素更能显著抑制磷酸二酯酶4型（PDE4）的活性,进一步激发PKA通路,其次可能通过共蛋白CBP/p300调节NF-κB炎症通路和Nrf2抗氧化通路的抑制或活化。结果初步分析了芹菜的清咽润肺药理作用的可能机制,为进一步芹菜的研究和开发利用提供理论基础。5.治咳川贝枇杷滴丸的药效学研究镇咳、祛痰、抗炎、平喘四种药理作用是评价药物对肺功能影响的经典指标。镇咳实验采用小鼠氨水引咳法,川贝替换平贝导致治咳川贝枇杷滴丸镇咳药效增强,能明显减少咳嗽次数,降低咳嗽对气管平滑肌的损伤;与京都念慈菴、强力枇杷露等中成药相比,咳川贝枇杷滴丸虽未能迅速镇咳,可能由于京都念慈菴、强力枇杷露中蜂蜜的润喉作用更加显著,但在减少咳嗽的次数上比较有优势。祛痰实验采用小鼠气管分泌酚红的动物模型,治咳川贝枇杷滴丸在祛痰作用上,与阳性药无明显差异,并且平贝在制剂中的祛痰药理活性优于川贝制剂。抗炎作用研究采用两种动物模型,急性抗炎实验采用脂多糖（LPS）致小鼠肺部急性损伤模型,慢性实验采用长期氨水雾化吸入致小鼠慢性支气管炎模型,综合两种抗炎模型,川贝替换平贝后,抗炎效果增强,并且抗炎效果优于京都念慈菴和强力枇杷露,与川贝母中较高皂苷含量相关;平喘实验我们采用磷酸组胺雾化吸入致豚鼠哮喘模型,治咳川贝枇杷滴丸平喘效果与临床常用药京都念慈菴、强力枇杷露没有显著性差异,而且川贝替换平贝后,平喘效果较弱,文献报道可能由于平贝生物碱含量偏高。通过以上药理实验,比较了治咳川贝枇杷滴丸与目前常用止咳平喘中成药的作用差异,明确了其治疗特色;同时比较川贝母与平贝母在治咳川贝枇杷滴丸药剂中的药效学差异,肯定了川贝母与平贝母在肺部疾病治疗中不同种的特色,也为川贝母与平贝母在其他制剂中的应用有指导意义,更好的针对性用药。综上所述,本论文的研究结果为芹菜的清咽药效物质基础提供了理论依据,也为其机制初步进行了推测和证实,为肺部等炎症疾病的研究开发提供了科学依据。同时采用抗炎、祛痰、镇咳、平喘四种药理实验模型明确了治咳川贝枇杷滴丸的治疗特色,为临床应用提供理论依据;此外为临床合理区别使用川贝母与平贝母的的制剂提出合理建议。