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目的:克隆家蝇小热休克蛋白Hsp20.6基因,研究该基因在家蝇各生长发育阶段的表达情况,并进行原核表达,为最终阐明其生物学功能奠定基础。 方法:应用生物信息学方法分析家蝇小热休克蛋白Hsp20.6理化性质、疏水性、跨膜区和信号肽、膜体分析、二级结构功能域、预测功能,进行多重序列比对与系统发育树构建和三级结构建模。分别采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR研究Hsp20.6在家蝇卵、3日龄幼虫、蛹、成虫4个生长发育阶段及成虫头部、胸部、腹部不同组织中的表达情况。利用pET28a(+)原核表达载体构建家蝇小热休克蛋白Hsp20.6基因的重组表达载体,并进行诱导表达与产物纯化。 结果:1、生物信息学分析表明家蝇小热休克蛋白Hsp20.6为亲水蛋白,分子量为20.64kD,等电点为5.66,不具有跨膜区和信号肽,有一个HSP20的结构域,二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲,该蛋白三维结构为棒状结构,其C端有7个片层结构。进化树显示,家蝇小热休克蛋白Hsp20.6与昆虫中的直系同源小热休克蛋白(orthologous small heat shock protein)聚为一类。2、半定量PCR与实时荧光定量PCR表明家蝇小热休克蛋白Hsp20.6为组成型表达,而且热诱导能上调该基因在家蝇卵、3日龄幼虫、蛹、成虫4个生长发育时期的表达,上调量以幼虫和成虫两时期为大。在成虫中则以头部组织上调最为明显。3、成功构建pET28a(+)- Hsp20.6重组表达载体,IPTG诱导表达产物大小与生物信息学预测结果相当。 结论:家蝇小热休克蛋白Hsp20.6基因为组成型表达,热诱导能上调该基因表达,生长时期以幼虫和成虫上调最为明显,在成虫头部组织中表达上调量最大。系统进化树表明该基因为昆虫直系同源小热休克蛋白基因,重组表达结果显示该蛋白大小在21kD左右。结构上,该蛋白具有小热休克蛋白的典型结构。