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EGFR(Epithelial growth factor receptor,表皮生长因子受体)是由原癌基因C-erbB-1(HER-1)编码的分子量为170 KDa(Kilodalton,千道尔顿)的跨膜糖蛋白。EGFR本身具有酪氨酸激酶的活性,一旦与EGF(Epithelial growth factor,表皮生长因子)或者其它相关配体结合即可启动细胞内的信号传导通路,刺激有关基因表达,从而促进细胞分裂增殖,因此EGFR在细胞生理过程中发挥着重要的调节作用。人们在许多上皮恶性肿瘤中都发现有EGFR的异常高表达,证实EGFR与癌细胞的快速增殖、新生血管的形成、肿瘤侵袭与转移,以及细胞凋亡的抑制等等有关,因此提示EGFR有可能成为治疗肿瘤疾病的潜在靶点。抗EGFR单克隆抗体是能够与EFGR特异性结合,通过竞争性抑制EFGR与其配体结合,从而达到抑制细胞增殖信号传导的靶向性抗体。目前最早上市的抗EGFR单克隆抗体是2004年被美国FDA(the Food and Drug Administration)批准的西妥昔单抗(cetuximab,Erbitux?),是一种重组的抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体,用于治疗转移性结直肠癌。该产品已于2009年获批进入中国市场销售,中文商品名:爱必妥。Erbitux的生产制备使用了SP2/O小鼠骨髓瘤细胞表达系统。上海抗体药物国家工程研究中心利用基因工程技术开发了一种重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体(Recombinant Chimeric Anti-EGFR Monoclonal Antibody,以下简称Anti-EGFR),该抗体是原研药Erbitux的生物类似药(Follow-On Biologics,FOB,本文又称受试药),生产制备采用了CHO(Chinese Hamster Ovary Cell,中国仓鼠卵巢细胞)细胞表达系统并使用了自有的抗体生产工艺技术。单克隆抗体(Monoclonal Antibody,mAb)是一类大分子糖蛋白,有研究表明,细胞表达系统、细胞培养过程以及细胞培养条件会影响蛋白质的糖基化修饰,而蛋白质糖基化又与某些蛋白质功能相关,因此,为了了解和比较两种不同细胞表达系统所生产的重组抗EGFR单克隆抗体在蛋白质结构和功能方面存在哪些异同,以及受试药Anti-EGFR是否可以成为抗肿瘤治疗药物的候选药,本研究将以原研药Erbitux作为参考对照,针对受试药Anti-EGFR的蛋白质一级结构和高级结构进行表征分析和确证,并对其体内外抗肿瘤功能进行了研究和评价。在抗体结构表征分析中,本研究分别从一级结构、二级结构和三级结构上对受试药Anti-EGFR与原研药Erbitux的异同进行了全面和深入研究。首先,应用LC-ESI-Q-TOF技术,从质谱分子量、质量肽图、糖基化修饰逐步解析受试药Anti-EGFR的一级结构信息,并对差异进行重点解剖。我们研究发现,受试药-2-Anti-EGFR与原研药Erbitux具有相同的氨基酸序列,但在糖基化上存在重大差异:原研药Erbitux唾液酸化以NGNA型为主,含有较多galactose-a-1,3-galactose结构寡糖修饰,高甘露糖水平是受试药Anti-EGFR的6倍,存在较大的免疫原性风险;受试药Anti-EGFR唾液酸化以NANA型为主,基本不含α1-3型半乳糖;由于我们采用了与人细胞更接近的CHO细胞表达系统从而规避或大大降低了原研药Erbitux潜在的免疫原性高风险。其次,本研究还分析确证了两种抗体的蛋白质高级结构情况:受试药Anti-EGFR与原研药Erbitux的热熔变化趋势基本一致(Tm值基本一致),表明其折叠和稳定性基本一致;通过CD远紫外区和近紫外区扫描分析,显示两种单抗二级结构和三级结构的高度类似性;而且通过分子内部荧光分析,两种抗体的芳香族氨基酸残基的侧链基团构象基本一致,蛋白质整体空间构象没有发生变化。两种抗体的体外药效学研究结果显示,受试药Anti-EGFR在抗原结合能力、细胞增殖抑制能力以及ADCC作用方面与原研药Erbitux类似;受试药Anti-EGFR抗体能够显著抑制EGFR及其下游信号通路的磷酸化,并且对人表皮细胞癌A431(EGFR高表达的人肿瘤细胞株)具有较强的体外抗肿瘤生长抑制作用。两种抗体的体内药效学研究结果显示,受试药Anti-EGFR对人表皮细胞癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用非常显著,并且对受试药Anti-EGFR处理后的肿瘤组织进行免疫组化的分析,进一步确证受试药Anti-EGFR通过抑制肿瘤组织中EGFR磷酸化,抑制EGFR所参与调控的与细胞增殖密切相关的信号传导通路,从而抑制肿瘤细胞的增殖能力,发挥其抗肿瘤作用。本研究结果证实,受试药Anti-EGFR设计与原研药Erbitux相同的氨基酸序列和不同的细胞表达系统,达到大大降低引起免疫原性风险的NGNA、galactose-a-1,3-galactose结构、高甘露糖糖基化含量的设计目的,同时保证在蛋白质二级结构和三级结构方面高度类似,蛋白质整体空间构象没有发生改变,确保所期望的功能和药效,并且在随后的体内外药学研究中证实,受试药Anti-EGFR对EGFR高表达的人表皮细胞癌A431具有较强的抗肿瘤生长抑制作用,提示该受试药Anti-EGFR有望成为治疗以EGFR过表达为特征肿瘤疾病的新的候选药物。