糖尿病已成为全球性的公共健康问题，糖尿病缺牙患者的种植失败率较正常缺牙患者偏高。糖尿病缺牙患者缺牙区往往伴有牙槽骨缺损，其植骨效果也较正常缺牙患者差。如何提高糖尿病缺牙患者的种植修复成功率并研究出适合糖尿病缺牙患者的植骨材料一直是个难题。种植修复失败是糖尿病的并发症之一，其发病的病理生理基础与糖尿病其他并发症类似。糖尿病患者在长期高血糖状态下，细胞线粒体内发生氧化应激反应，生成的过氧化物和超氧自由基激活PKC通路、多元醇通路、己糖胺通路，形成糖基化终产物，损伤血管内皮细胞，造成微血管病变。糖尿病患者的代谢紊乱包括高血糖、代谢性酸中毒和胰岛素不足。持续的高血糖不仅会破坏骨质，还会影响骨质沉积、改建和矿化。胰岛素不足或胰岛素抵抗可导致成骨细胞数目减少，使成骨活性降低，抑制骨钙素合成，引起骨质疏松，造成种植体骨结合较差。AGEs刺激单核-巨噬细胞、内皮细胞释放细胞因子、炎性介质，影响骨质生成并加速骨质吸收。AGEs可与成骨细胞表面的受体结合，抑制成骨细胞分化，使成骨细胞数量及活性下降。针对糖尿病患者种植区域成骨细胞数量减少、活性下降，本研究通过组织工程技术，增加种植区域成骨细胞数量，增强其成骨能力。研究目的：本课题通过建立新西兰兔糖尿病模型，在新西兰兔胫骨干骺端植入纯钛种植体，并将ASCs加载于种植体周围，观察其对新骨生成以及种植体骨结合的影响，探讨ASCs在成骨及种植体骨结合中的可能作用机制，为提高糖尿病缺牙患者种植修复成功率提供新思路和理论依据。实验方法和结果：第一部分：方法：将新西兰兔耳缘静脉备皮、消毒。以戊巴比妥钠(3%，40mg/Kg)耳缘静脉注射麻醉，经耳缘静脉缓慢注射新鲜配制的四氧嘧啶（Alloxan, ALX）(50mg/ml，100mg/Kg)。分别于注药后第2h、4h、6h皮下注射5%葡萄糖溶液共10mL，预防低血糖，并在24h内提供10%葡萄糖饮水。建模期间每24h检测一次血糖，当空腹血糖(Fasting BloodGlucose，FBG)高于19.4mmol/L时，皮下注射胰岛素（1-4U/Kg）。建模后正常饲养5周，每周检测血糖及体重【1】。以FBG稳定在13.9mmol/L以上为建模成功的标准。结果：1.静脉注射ALX24-48h后新西兰兔出现萎靡、活动减少、食欲减退等症状。3d后开始出现多饮、多食、多尿等糖尿病症状。2只新西兰兔在ALX静脉给药24h内死亡，2只在给药后一周内死亡，其余均存活，另2只新西兰兔因空腹服血糖未达到13.9mmol/L而被排除。2.剩余14只新西兰兔经静脉注射ALX后空腹血糖由（5.92±0.75）mmol/L增加至(19.51±5.19)mmol/L，并稳定在13.9mmol/L以上。新西兰兔的体重较给药前有不同程度减轻(0.2-0.5Kg)。体重和血糖值与建模前相比，差异均有统计学意义（p<0.05）。小结：利用ALX选择性破坏新西兰兔胰岛β细胞，可使之出现糖尿病的症状，是建立糖尿病模型的有效手段。ALX静脉注射后，新西兰兔血糖升高，体重逐渐下降，并出现多饮多食多尿等糖尿病症状。ALX在中性水溶液中不稳定,在使用时应新鲜配制。由于ALX毒性较大，应注意加强监测血糖，并及时做相应处理，降低实验动物死亡率。第二部分方法：以戊巴比妥钠(3%，40mg/Kg)耳缘静脉注射麻醉新西兰兔，在无菌条件下切取腹股沟脂肪组织约3ml。去除肉眼可见的血管和筋膜，PBS冲洗后用眼科剪将脂肪组织剪成糜状，以0.25%Ⅰ型胶原酶消化60min。将消化离心获取的ASCs在37,50ml/L CO2，饱和湿度条件下培养。3d后首次换液，待细胞融合达90%时按1:3传代。倒置显微镜下观察细胞形态，拍照。取第3-5代ASCs，以成脂诱导培养液和成骨诱导培养液诱导分化，然后分别进行油红O染色和茜素红染色。倒置显微镜下观察，拍照。结果：1.初分离的ASCs呈圆形，直径约5μm，色深；接种4h后细胞开始贴壁，在最初的24-48h内细胞生长处于停滞期，48-72h后细胞完全贴壁、伸展，呈成纤维细胞样并集落样生长。2.成脂诱导后细胞增殖速度明显降低，细胞由长梭形变为椭圆形、三角形；诱导5天后细胞内开始出现小脂滴，随后脂滴逐渐增多增大，细胞内充满脂滴；油红O染色阳性。3.成骨诱导分化3天后细胞由梭形变为扁圆形，细胞核变圆，细胞体增大，胞膜有伪足伸展，胞质内细胞颗粒逐渐增多；细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，形成钙结节；茜素红染色呈红色结节。小结：本实验成功地从新西兰兔脂肪组织中分离获取了ASCs，传代培养后，经多向诱导分化证实ASCs具有干细胞活性。ASCs来源丰富、易于获取、体外扩增能力强、不涉及伦理和法律限制，是理想的组织工程种子细胞。以ASCs为种子细胞的组织工程技术在口腔种植中有着广阔的应用前景，有望解决糖尿病缺牙患者的种植修复难题。第三部分：方法：将建模成功的新西兰兔以戊巴比妥钠(3%，40mg/Kg)耳缘静脉注射麻醉，固定于手术操作台上。将双侧胫骨膝关节处备皮消毒，沿胫骨骺端内侧平面切开皮肤，分离肌肉及筋膜，暴露胫骨面；生理盐水冷却下，用小球钻及扩孔钻在胫骨平面中央逐级预备种植窝，植入经微弧氧化表面处理的纯钛种植体（规格：3.3x6mm），植入深度约2mm；用小球钻在种植体周围制备出血孔，为植骨材料提供血供。将实验动物的双侧胫骨随机分配到实验组和对照组。在实验组种植体周围植入0.3ml ASCs悬液（浓度1x108/ml）与50mg Bio-Oss骨粉的混合物；对照组种植体周围植入等量生理盐水与Bio-Oss骨粉的混合物。然后以钛帽将植骨材料覆盖在种植体上，用微型螺丝固定【2】。分层严密缝合手术切口。术后肌注硫酸庆大霉素（40万U/日）3-5天，观察伤口愈合情况。分别于术后第4、8、12周取材，进行Micro-CT扫描分析，硬组织切片，并行丽春红染色。观察植骨区骨质生成情况及种植体骨结合情况。结果：1.术后有2只新西兰兔因伤口感染而被排除，其余12只伤口愈合良好。分别于术后第4、8、12周取双侧胫骨标本，去除软组织和钛帽后可见种植体被新生骨质和植骨材料覆盖，未见软组织增生。2. Micro-CT三维重建图像可见：术后4周时，新西兰兔双侧植骨区距种植体1.0mm区域均有少量新骨生成，实验组和对照组差异不明显；而术后8周和12周时，实验组植骨材料之间可见较多新生骨质，骨体积分数(BV/TV)高于对照组（p<0.05）。3.丽春红三色染色显示：术后4周时，实验组和对照组均有新生骨质生成，两者差异不明显；术后8周时，对照组植骨材料周围新生骨骨量仍然较少，较稀疏，而实验组植骨材料已逐步被新生骨所取代；术后12周时，实验组植骨材料之间有较多新生骨，新生骨组织与种植体实现骨结合，而对照组植骨材料之间新生骨组织较少，连续性差，新生骨与种植体的骨结合亦不如实验组。小结：本实验利用组织工程技术，把ASCs与Bio-Oss骨粉复合后植于糖尿病兔种植体周围。术后8周和12周检测结果显示，实验组的成骨状况以及种植体的骨结合情况均优于对照组。提示将ASCs局部应用于种植体周围，可在一定程度上提高糖尿病缺牙患者的种植成功率。结论：1.新西兰兔耳缘静脉注射ALX(100mg/kg)可以建立稳定的糖尿病动物模型。但应注意血糖管理，降低死亡率。2.兔脂肪组织可以分离获取ASCs，ASCs易于传代及扩增。经多向诱导分化鉴定证实，获取的ASCs具有干细胞活性。3.将ASCs加载于种植体周围，术后8周、12周可见ASCs干预组种植体周围新生骨骨量高于对照组，骨结合情况也优于对照组。4.以ASCs为种子细胞的组织工程技术有望成为解决糖尿病患者种植修复难题的理想方案。