目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统变性疾病,病情呈进行性加重,在几年内丧失独立生活能力,10年左右常因并发感染而死亡。由于老年人群的增长,AD已成为现代社会的常见病,引起了研究者们的关注。AD的典型病理特征是神经细胞内出现神经元纤维缠结,神经细胞外存在神经炎斑或称老年斑,老年斑的中心为β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)。Aβ是含有40-42个氨基酸的多肽,可诱导神经元的凋亡和突触丢失,损伤胆碱能神经元,影响细胞Ca2+的平衡,Aβ诱导产生的活性氧自由基可破坏细胞膜,促使脂质过氧化和膜蛋白损伤。生理情况下Ap是可溶的,低浓度不表现神经毒性,当可溶性的Aβ达到了临界浓度,就会发生构象的变化,从单体聚集形成具有稳定构象的寡聚体或纤维。Aβ在AD病人脑中有几种不同形式,包括可溶性的单体、寡聚体和不可溶的纤维。其中,寡聚体是毒性最大的。Aβ具有很强的自我聚集能力,寻找一些分子阻止或干扰Ap聚集或减轻其毒性已成为AD治疗的理想靶标。研究表明,适当的饮用红葡萄酒可以减轻AD病人的认知功能障碍及淀粉样沉积的病理变化。红葡萄酒中含有大量的多酚类物质,这些多酚类物质可以与一些肽或蛋白结合,起到了预防和治疗不同疾病的作用。多酚类物质具有潜在的抗淀粉样蛋白活性,从葡萄籽中提取出来的多酚类物质可以减少Aβ产生,抑制Aβ聚集和毒性,姜黄素也能有效减少脑内Aβ毒性和小胶质细胞的激活。本研究以毒性较大的Aβ42为研究对象,探讨了两种多酚类物质白藜芦醇(Resveratrol, Res)和鞣花酸(Ellagic acid, EA)对其聚集和细胞毒性的影响,为寻找预防和治疗AD的理想药物提供依据。另外,在实验中通过比较Aβ氨基端多肽的细胞毒性,发现高浓度Aβ1-16具有明显的细胞毒性,且该毒性作用呈剂量依赖关系,因此针对Aβ1-16的毒性及其是否引发炎症反应进行了一系列的研究。实验方法1、Res对Aβ42聚集及细胞毒性的影响(1)将不同浓度Res(0、2、1 0、1 00μM)与Aβ42(10μM)37℃共同孵育,分别于0 h、7 h、14 h、21 h、28 h取样,通过硫磺素T(Thioflavin T,ThT)荧光方法检测Res对Aβ42聚集的影响；(2)Aβ42(10μM)与Res(0、10、1 00μM)共同孵育,分别于28 h和3 d各取样1 0μL,通过透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察Res对Aβ42聚集过程的影响；(3)Aβ42(40μM)与Res(400μM)共同孵育,以单独孵育的Aβ42为对照,分别于0 h、11 h、15 h、18 h、24 h取样,通过圆二色谱仪(Circular Dichroism,CD)检测Res对Aβ42二级结构变化的影响；(4)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa)和斑点印迹法(dot-blot)检测加入Res后,不同时间点Aβ42寡聚体含量的改变；(5)western-blot观察Res对Aβ42聚集的影响和对Aβ42纤维的解聚作用；(6)细胞毒性分析实验(MTT法)检测Res对Aβ42所致细胞毒性的影响。2、EA对Aβ42聚集及细胞毒性的影响(1) Aβ42 (10μM)和EA(100μM)共同孵育,分别于2 h、6 h、12 h、24 h取样10μL,以单独孵育的Aβ42为对照,观察聚集过程的变化；(2)Aβ42与EA共同孵育6 h,通过western-blot方法检测与Aβ42单独孵育形成蛋白的差异；(3) Aβ42 (10μM)和EA (100μM、300μM)共同孵育1 2 h和24 h,以单独孵育的Aβ42为对照,Elisa方法检测EA对Aβ42聚集形成寡聚体含量的影响；(4) Aβ42 (40μM)与EA (300μM)共同孵育,分别于0 h、4 h、6 h取样,以单独孵育的Aβ42为对照,通过圆二色潜仪检测EA对Aβ42二级结构变化的影响；(5)MTT法检测不同浓度EA对Aβ42所致细胞毒性的影响。3、Aβ1-16毒性及炎症反应的研究(1)MTT法比较Aβ42 N端多肽的细胞毒性；(2)MTT法测定不同浓度Aβ1-16的细胞毒性；(3)不同孵育温度、时间对Aβ1-16细胞毒性的影响；(4)利用Elisa试剂盒检测Aβ1-16对BV-2小胶质细胞释放炎症因子的影响；(5)小鼠脑海马区定位注射Aβ1-16；(6)利用Morris水迷宫测定小鼠的学习和空间记忆能力；(7)免疫组化检测注射Aβ1-16后,星形胶质细胞的表达变化。结果1、Res对Aβ42聚集及细胞毒性的影响(1)ThT、TEM和CD的结果表明,Res抑制Aβ42的聚集；(2) Elisa、Dot-blo、western-blot和TEM结果表明,Res不抑制Aβ42寡聚体的形成,稳定寡聚体的存在；(3)ThT, western-blot和TEM结果表明,Res对Aβ42纤维具有解聚作用；(4)MTT结果表明,与2μM Res共同孵育使Aβ42对SH-SY5Y细胞的毒性明显降低,10μMRes使Aβ42纤维所致的细胞毒性明显降低。2、EA对Aβ42聚集及细胞毒性的影响(1)TEM和western-blot结果表明,EA加速Aβ42的聚集；(2)Elisa结果表明,与EA共同孵育12 h和24 h后,显著减少了Aβ42寡聚体的含量；(3)CD结果表明,加入EA后,在215 nm形成更大的负峰,说明EA加速了β-片层结构的形成；(4)MTT结果表明,EA显著降低了Aβ42引起的细胞毒性。3、Aβ1-16毒性及炎症反应的研究(1)Aβ1-1 6以30μM作用于SH-SY5Y细胞48 h后,细胞数量明显减少,形态不规则,边缘不清晰,有聚堆现象；(2)MTT结果表明,Aβ1-16对SH-SY5Y细胞的毒性呈剂量依赖的形式,随着浓度的增加,细胞毒性逐渐增加；(3)将Aβ1-16分别于4℃,37℃孵育3 d和7 d,结果表明,随着孵育时间的延长,Aβ1-16引起的细胞毒性逐渐下降；(4)Aβ1-16(30、100μM)刺激了BV-2小胶质细胞TNF-α的分泌,不影响IL-1β的分泌；100μM的Aβ1-16明显提高了BV-2小胶质细胞分泌IL-4的水平；(5)水迷宫实验结果：与对照组和Aβ1-8组相比,Aβ1-16组的学习和空间记忆能力要差。(6)免疫组化结果表明,脑海马区注射Aβ1-16后,引起了星形胶质细胞的激活。结论1、Res抑制Aβ42聚集成纤维,但不抑制寡聚体的形成；2、Res对Aβ42纤维具有解聚作用；3、Res可以减轻Aβ42对SH-SY5Y细胞的毒性；4、EA促进Aβ42聚集,减少寡聚体存在的时间,并抑制Aβ42所致的细胞毒性；5、Res和EA影响Aβ42聚集的路径不同,但都减轻了Aβ42的细胞毒性,一方面可能由于它们的抗氧化作用,另一方面则由于它们与Aβ42结合后,可能改变了毒性较大的寡聚体的构象,从而减轻了细胞毒性；6、Aβ1-16具有细胞毒性,且呈浓度依赖关系；并能刺激BV-2小胶质细胞炎症因子TNF-α及IL-4的分泌；海马区注射Aβ1-16后,会导致记忆损伤,增加星形胶质细胞的表达。