白血病抑制因子Lif (Leukemia inhibitory factor)最早于1988年在小鼠KrebsⅡ腹水瘤细胞条件培养液中分离纯化,因其能诱导白血病细胞株M1细胞向正常细胞分化而得名,它是白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)亚家族的重要成员。哺乳动物的大量研究显示,Lif具有广泛的生物学功能,在神经元的存活、形成与修复、血细胞生成、激素产生、胚胎发育等方面均具有重要作用。近年来,Lif被大量应用于临床及科研,具有极大的市场需求量。在临床上Lif被用于预防癌症病人化疗引起的神经病变、促进不孕妇女移植胚胎的着床等,在科研中被广泛应用于神经干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等的体外培养,是维持其未分化状态的必需因子,占干细胞体外培养成本的90%以上。因此,如何能够大量获得具有生物学活性的Lif显得尤为必要。目前,Lif的重组表达主要问题是表达量低,原核表达主要以包涵体形式,难以获得具有生物学活性的蛋白。低等脊椎动物硬骨鱼类是否存在哺乳类Lif的同源分子,其功能如何,尚待研究。本研究以罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明,用于实验研究的罗非鱼均指尼罗罗非鱼)Oreochromis niloticus))为实验对象,分离、鉴定lif的cDNA序列,并通过半定量RT-PCR方法检测其在胚胎发育及不同组织中的表达模式；构建pET22、pET28a及pSUMO (small ubiquitin-related modifier)原核表达载体,获得可溶状态的纯化蛋白ntLif32-221,并对其生物学功能进行初步研究。另一方面,鱼类性腺细胞由体细胞与生殖细胞组成,其中体细胞包括卵巢的颗粒细胞、鞘膜细胞、间质细胞,及精巢的Sertoli细胞、Leydig细胞等,自世界上首株鱼类细胞系即虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞系RTG-2建立以来,目前仅在少数鱼类如青鳉、牙鲆、南方鲇等建立了性腺的细胞系。罗非鱼是研究鱼类性别决定与分化的良好动物模型,其性腺细胞系的建立将为生殖细胞增殖与分化、相关功能基因研究等提供有力手段。迄今,尚未见罗非鱼性腺来源细胞系建立的相关报道。基于此,本研究还开展了罗非鱼精巢、卵巢体细胞与生殖细胞体外培养条件及其生殖细胞移植的初步探索。主要研究结果如下：1.罗非鱼白血病抑制因子(ntlif)cDNA的分离鉴定、可溶性表达及其生物学活性1.1通过生物信息学分析与RT-PCR方法相结合,从罗非鱼克隆白血病抑制因子cDNA序列,结果显示：ntlif由3个外显子组成,cDNA全长1067 bp,其中5’端UTR 153bp,3’端UTR 248bp,ORF 666 bp,编码221个氨基酸,第1-31位为信号肽序列,具有两个链内二硫键,两个N-糖基化位点,与哺乳类结构特征类似；系统进化分析表明,ntlif为哺乳类Lif/Osm的直系同源基因；氨基酸多重序列分析表明,罗非鱼Lif与鱼类的氨基酸一致性达35.5%以上,而与哺乳动物Lif的氨基酸一致度仅约为18.0%,保守性较低,lif基因存在种属特异性。ntLif蛋白理论分子量为21.294 KDa,等电点为8.83。1.2通过RT-PCR检测结果显示,从受精后12 h至第5天均有lif较高水平的表达,提示ntLi呵能在罗非鱼胚胎发育的整个过程中发挥生物学效应。与此同时,ntLif广泛表达于成年鱼不同组织,其中心脏、脾脏、肠、肌肉表达水平较高。1.3成功构建了罗非鱼除信号肽第1-31位氨基酸的Lif32-221原核重组表达载体pET22.pET28a及pSUMO,将其转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),通过不同浓度IPTG.不同温度、不同时间诱导,SDS-PAGE及Western-blot检测,结果显示,pSUMO-ntLif32-221转化阳性菌经O.2 mM IPTG 16℃诱导20 h,可获得重组蛋白 His6-SUMO-Lif32-221最大可溶性表达,特异性条带对应分子量约37 kD与理论值相符；经Ni柱亲和层析及ULP1酶解,获得了去His6-SUMO的纯化蛋白ntLif32-221,特异性条带对应分子量约25 kD与理论值相符,产量约10 mg/L。1.4通过FACS、CCK8法检测纯化蛋白ntLif32-221对青鳉胚胎干细胞(MES1)增殖活性的影响,结果显示,纯化蛋白ntLif32-221可促进MES1的增殖。2罗非鱼性腺细胞培养及生殖细胞移植2.1取3月龄罗非鱼精巢、卵巢组织经胶原蛋白酶Ⅳ及胰蛋白酶-EDTA消化,于28℃进行培养,结果发现,罗非鱼性腺细胞在L-15条件培养基中生长状态良好,其成分为：含15%胎牛血清(FBS)、25mM Hepes、1%非必需氨基酸、0.5mMβ-巯基乙醇、白血病抑制因子(LiD、500U/mL青霉素及链霉素和5%罗非鱼自身血清的L-15培养基。2.2在L-15条件培养基中,罗非鱼精巢、卵巢体细胞分离培养2-3天后,开始成纤维细胞样生长,约15天后长满单层,用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化,1：2进行传代培养,传代后初期细胞生长较为缓慢,平均7-10天进行传代,传至第9代后,细胞生长加快,平均3-6天进行传代；现细胞经120 d的继代培养,精巢体细胞已稳定传至第14代,卵巢已稳定传至第12代,将其分别命名为NTT、NTO。2.3在L-15条件培养基中,罗非鱼生殖细胞不贴壁或贴壁不牢,从而明显区别于体细胞,第1周可观察到精原细胞、卵原细胞样的细胞增殖,约第3周可观察到具有活性的精子的产生,从而表明,罗非鱼生殖细胞可在体外进行有效培养,并完成配子的产生过程。2.4以白硝胺与环磷酰胺处理成年雌性罗非鱼(XX)以消除内源性生殖细胞为受体鱼,以Hoechst33342标记雄性罗非鱼(XY)生殖细胞悬液为供体细胞,将供体细胞通过生殖孔显微注射到处理过的受体鱼性腺内,20天后取受体鱼性腺组织,通过组织切片的荧光显微观察及PCR检测Y性别特异标记分子,结果显示,未能在受体鱼性腺中检测到供体细胞的信号。该研究首次获得了低等脊椎动物Lif的可溶性纯化蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了重要基础。此外,罗非鱼性腺细胞培养的初步研究将促进其生殖细胞增殖与分化调控、功能基因等的相关研究。