论文部分内容阅读
目的:研究双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对胃癌MKN45细胞增殖、凋亡的影响,并探索其可能的机制,明确DHA在胃癌治疗中的可行性及其作用的发挥与核糖体蛋白L23(Ribosome protein L23,RPL23)活性状态是否存在关系。方法:(1)根据Pubmed人RPL23基因序列,设计3条引物,通过脂质体转染化学合成的RPL23-si RNA干扰片段,使用实时荧光定量PCT(Real-time PCR,RT-PCR)、蛋白印记实验(Western blot,WB)进行干扰效率鉴定;(2)使用不同浓度梯度的DHA作用MKN45细胞,MTT实验检测细胞增殖情况,确定DHA的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50);(3)使用DHA及si RNA转染共处理MKN45细胞,将实验分为4组:对照组(NC组)、RPL23-si RNA组、DHA组、DHA+RPL23-si RNA组,用甲基噻唑基四唑(Methylcyclopentadienyl Manganese Tricarbonyl,MTT)实验测定细胞增殖、流式细胞术(Flow cytometry,FCM)测定细胞凋亡及细胞周期,激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察细胞中RPL23、鼠双微体2(Murine double minute 2,MDM2)蛋白定位,WB实验检测RPL23、MDM2、B细胞易位基因2(B cell translation gene 2,BTG2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达;(4)实验数据采取均数±标准差(?),SPSS 19.0进行统计分析。结果:(1)构建并筛选出最佳RPL23-si RNA干扰片段:RT-PCR鉴定结果显示,正常细胞组、对照组、si RNA1组、si RNA2组、si RNA3组5组中RPL23m RNA表达水平具有具有显著统计学差异(P<0.01),多重比较发现,si RNA1组干扰效率明显高于RPL23-si RNA2组(P<0.01)及RPL23-si RNA3组(P<0.01),WB鉴定与上述结果一致,可以认为,si RNA1是最佳干扰序列,可用于后续实验。(2)DHA IC50值的确定:MTT实验检测了不同浓度梯度的DHA对于MKN45增殖的影响,MKN45的抑制率与药物浓度之间呈现出剂量依赖性,随着药物浓度的增加,MKN45细胞的抑制率随之增加,当DHA浓度为160um/L时,细胞增殖抑制率为50%左右,说明,160um/L可作为DHA的IC50值。(3)MTT实验及FCM实验显示,DHA可明显抑制胃癌MKN45增殖,诱导细胞凋亡,NC组、RPL23-si RNA组、DHA组、DHA+RPL23-si RNA组细胞的平均凋亡率之间存在统计学差异(P<0.01)。细胞周期实验显示,4组细胞数在G1期、S期均表现出统计学差异(P<0.01),RPL23抑制表达后,MKN45细胞的G1期细胞数目减少,S期细胞数目增多,说明RPL23-si RNA促进了细胞周期G1/S期转化,而经过DHA再次处理后,则出现了不同程度的G1/S期转化抑制。用激光共聚焦显微镜观察到,正常的MKN45细胞中,RPL23主要表达在细胞浆,MDM2则主要表达于细胞核浆,使用RPL23-si RNA转染后,细胞浆中的RPL23明显降低,而MDM2则出现了细胞核中的浓聚,而DHA处理后,两组细胞中的RPL23再次出现了胞浆中的不同程度浓聚,而MDM2则在细胞核浆中出现了荧光减弱。WB实验观察到4组细胞中RPL23(P<0.01)、MDM2(P<0.01)、Cyclin D1(P<0.01)、BTG2(P<0.01)均存在统计学差异。结论:DHA可通过RPL23-MDM2信号通路上调RPL23、BTG2表达、抑制MDM2、Cyclin D1表达发挥抗胃癌MKN45细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。