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目 的:本研究基于TSHR及受体后甲状腺细胞增殖与凋亡的信号转导通路探讨GD甲状腺肿的发病机制。应用滋阴降火散结复方进行干预治疗,验证其对甲状腺刺激抗体(TRAb)诱导FRTL-5细胞增殖和凋亡的影响,为GD甲状腺肿预防治疗提供新的理论依据。研究方法:1含药血清制备:取6-8周Wistar大鼠共10只雌雄各半(200g±30/只),适应性喂养2周,分为对照组、滋阴降火散结方低浓度组、滋阴降火散结方中浓度组、滋阴降火散结方高浓度组及赛治组共五组,于末次灌胃后1h腹主动脉取血,分离血清,0.22um过滤除菌,经56℃30min灭活后,-20℃保存备用。2甲状腺细胞的培养与加药:取FRTL-5大鼠甲状腺细胞株,进行复苏,将复苏后的细胞置于含有完全培养液的离心管中进行离心处理,后将细胞置于培养基中培养,观察细胞形态。待细胞密度长至90%左右,取细胞按1:2的比例进行传代培养。将离心后细胞重悬。取适量细胞悬液用PBS进行稀释,将稀释后细胞滴入计数板内,放置于显微镜下进行细胞计数。最后将前三代状态良好处于对数增长期细胞进行冻存处理。细胞加药是将FRTL-5细胞株置于完全培养基中培养,待细胞长至80%-85%左右,将细胞按实验进行分组培养于取出促甲状腺激素的不完全培养基中进行饥饿处理,几组细胞分别为正常组:加入正常大鼠血清;模型组:加入M22和正常大鼠血清;低浓度方组:加入M22及低浓度中药含药血清;中浓度方组:加入M22及中浓度中药含药血清;高浓度方组:加入M22及高浓度中药含药血清;赛治组:加入M22及甲巯咪唑片(赛治)含药血清,其中M22浓度为0.1 μg/ml。观察细胞生长情况。3应用MTT法检测各组细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞调亡情况;Western blot蛋白印迹法检测 PKA C-α、p-PKAC(Thr197)、CREB、p-CREB(Ser133)以及 ERK、p-ERK(Thr202/Tyr204)蛋白的表达情况。结 果:1 MTT法检测各组细胞增殖情况通过MTT法检测各组FRTL-5细胞的OD值,结果显示,与正常组相比模型组OD值明显升高。其中滋阴降火散结中药中浓度组低于模型组,差异存在统计学差异(P<0.05);滋阴降火散结中药高浓度组低于模型组,差异存在统计学差异(P<0.05);赛治组低于模型组,差异存在统计学意义(P<0.05)。滋阴降火散结中药低、中、高浓度组与赛治组差异有统计学意义(P<0.05)。2流式细胞术检测各组细胞凋亡情况滋阴降火散结中药低、中、高浓度均能诱导FRTL-5细胞凋亡,且其凋亡率随浓度的增加而增高。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,其中与正常组相比模型组细胞凋亡率明显降低。滋阴降火散结中药低浓度组细胞凋亡率高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);滋阴降火散结中药中浓度组细胞凋亡率高于模型组,差异存在统计学意义(P<0.05);滋阴降火散结中药高浓度组细胞凋亡率高于模型组,差异存在统计学意义(P<0.05);赛治组细胞凋亡率高于模型组,差异存在统计学意义(P<0.05)。滋阴降火散结中药低、中、高浓度组与赛治组差异存在统计学意义(P<0.05)。3Western blot检测蛋白表达Western blot检测法检测药物干预后蛋白表达,各组大鼠甲状腺细胞p-PKA C、PKA C-α蛋白表达,模型组明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。其中滋阴降火散结中药中浓度组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);滋阴降火散结中药高浓度组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);赛治组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。滋阴降火散结中药低、中、高浓度组与赛治组差异存在统计学意义(P<0.05)。Western blot检测法检测药物干预后蛋白表达,p-CREB/β-actin相对表达量,模型组明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。其中滋阴降火散结中药中浓度组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);滋阴降火散结中药高浓度组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);对照组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。滋阴降火散结中药各组与赛治组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测法检测药物干预后蛋白表达p-ERK/β-actin相对表达量,模型组明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。滋阴降火散结中药低浓度组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);滋阴降火散结中药中浓度组细胞凋亡率低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);滋阴降火散结中药高浓度组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);赛治组相对表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。滋阴降火散结中药各组与赛治组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结 论:1滋阴降火散结中药含药血清能有效抑制TRAb作用下FRTL-5细胞过度增殖,并存在剂量依赖性。2滋阴降火散结中药含药血清能诱导TRAb作用下FRTL-5细胞发生凋亡,结果存在剂量依赖性。3滋阴降火散结中药能有效下调PKA、CREB、ERK等TRAb相关受体后通路相关蛋白表达。这可能是滋阴降火散结中药治疗GD的关键所在。