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一.目的与意义人胚胎的发育成熟及着床是一个复杂的过程。其过程包括:受精卵形成,并沿着输卵管向子宫腔内移动,同时伴随卵裂。经历2-细胞期,4-细胞期,8-细胞期后,逐渐发育形成含有多个细胞的桑椹胚,最终发育为成熟的胚泡。成熟的胚泡进入子宫腔内之后,与子宫内膜相互作用,开始胚胎着床过程。胚胎着床的过程主要包括三个步骤,即胚泡的定植,胚泡与子宫内膜的黏附及胚泡侵入子宫内膜的过程。胚胎的发育成熟及着床是建立和维持妊娠的关键步骤。这一过程中,胚胎和内膜阶段特异地表达的分子,参与调控胚胎发育成熟及着床过程。妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A,PAPPA)是由胎盘所分泌的一种蛋白质。PAPPA在妊娠的第五周孕妇的血清中可以检测到,随着妊娠过程的进行,血清中的PAPPA含量持续升高,至妊娠末期达到峰值。研究发现,在早孕期,PAPPA的水平与许多疾病,如先兆流产等的发生密切相关,这提示我们PAPPA可能在妊娠早期有重要的作用,但是目前还没有关于PAPPA与胚胎的发育成熟和着床的相关性的报道。糖基转移酶及其产物与胚胎发育,炎症反应,肿瘤发生发展等过程密切相关。岩藻糖基转移酶是糖基转移酶家族的重要成员。根据催化合成糖基化位点的不同,岩藻糖基转移酶家族(Fucosyltransferases,FUTs)主要有两大类:一类是催化合成N-岩藻糖苷键的岩藻糖基转移酶,如FUT4、FUT7等;另一类是催化合成O-岩藻糖苷键的岩藻糖基转移酶(protein O-fucosyltransferases,poFUTs),如poFUT1和poFUT2。研究发现,FUT4和FUT7在胚胎着床过程中有重要作用,关于poFUT1和poFUT2在胚胎着床过程中的作用及机制尚无报道。激素和细胞因子在胚胎发育成熟及着床过程中发挥重要作用。其中,孕酮和白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)的作用尤为重要。研究发现,孕酮在卵裂期能促进胚胎细胞的增殖而促进胚胎的发育成熟。此外,LIF通过增加胚胎的滋养层细胞的侵袭能力而促进胚胎着床。孕酮和LIF均可以与其受体结合,参与调节与胚胎发育成熟和着床相关的多种因子的表达。本文通过对PAPPA和poFUT1的表达调控的研究,探讨PAPPA和poFUT1及其上游分子孕酮和LIF在胚胎发育成熟和着床过程中的作用,为临床判断胚胎的质量及诊断先兆流产提供新的思路和理论依据。二.实验方法(一)妊娠相关血浆蛋白A的表达调控与胚胎着床相关性的研究1. ELISA分析孕妇血清中PAPPA水平与孕酮的表达水平;2. RT-PCR检测人绒毛及蜕膜组织中PAPPA的表达水平;3. WB检测人绒毛及蜕膜组织中PAPPA的表达水平;4.免疫组化和免疫荧光检测人绒毛及蜕膜组织中PAPPA的表达水平;5. Real-time PCR及ELISA检测人滋养层细胞(JAR)中PAPPA的表达水平;6.利用脂质体转染瞬时转染PAPPAsiRNA至JAR细胞中,下调PAPPA的表达;7. CCK-8及细胞计数分析细胞的增殖能力;8.采用体外胚胎黏附模型检测JAR细胞的黏附能力。(二)O-岩藻糖基转移酶的表达调控与胚胎着床相关性的研究1.免疫组化检测正常早孕及先兆流产妇女的绒毛组织中poFUT1和poFUT2的表达水平;2. ELISA检测正常早孕及先兆流产妇女的血清中LIF的表达水平;3.免疫荧光检测JAR细胞中poFUT1的表达水平;4. Real-time PCR检测JAR细胞的poFUT1的表达水平;5. WB检测JAR细胞的poFUT1的表达水平;6. Transwell法分析JAR细胞的迁移和侵袭能力;7.利用脂质体转染的方法瞬时转染poFUT1siRNA至JAR细胞中,下调poFUT1的表达;8.明胶酶谱实验分析JAR细胞中MMP-2的活性;9. WB检测JAR细胞中TIMP-1/-2,STAT和PI3K/Akt信号通路的相关分子的表达。三.结果(一)妊娠相关血浆蛋白A的表达调控与胚胎着床相关性的研究1.孕妇血清中PAPPA的表达与血清中的孕酮水平相关;2. PAPPA仅在人绒毛组织中的表达;3.孕酮可以促进JAR细胞中的PAPPA的表达;4.下调PAPPA的表达可以抑制JAR细胞的黏附与增殖;5.孕酮通过上调JAR细胞中PAPPA的表达而促进JAR细胞的黏附与增殖。(二)O-岩藻糖基转移酶的表达调控与胚胎着床相关性的研究1. poFUT1和poFUT2在绒毛组织中表达,并且在先兆流产组的poFUT1的表达水平低于正常早孕组;2.先兆流产组血清中LIF的表达水平低于正常早孕组;3. poFUT1在JAR细胞中表达;4. poFUT1的表达与绒毛组织和JAR细胞迁移,侵袭能力相关;5. LIF上调JAR细胞中poFUT1的表达;6. LIF通过上调poFUT1的表达促进体外培养的绒毛组织和JAR细胞的迁移及侵袭能力;7. LIF通过poFUT1介导的PI3K/Akt信号通路促进JAR细胞的迁移以及侵袭能力。四.结论(一)妊娠相关血浆蛋白A的表达调控与胚胎着床相关性的研究1.孕妇血清中PAPPA的表达与孕酮水平呈正相关;2. PAPPA仅在人绒毛组织中表达;3.在JAR细胞中,孕酮可以上调PAPPA的表达;4.在体外黏附模型中,PAPPA可以促进JAR细胞的黏附与增殖。(二)O-岩藻糖基转移酶的表达调控与胚胎着床相关性的研究1. poFUT1和LIF在先兆流产病人的血清中表达下降;2. LIF上调JAR细胞中poFUT1基因的表达;3. poFUT1促进人绒毛组织和人滋养层细胞的迁移及侵袭能力;4. LIF通过上调poFUT1的表达及其介导的PI3K/Akt信号通路促进JAR细胞的迁移以及侵袭。