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研究目的百草枯(paraquat, PQ),又名对草快、克芜踪等,由于其除草效果好,对环境污染小,被国内外广泛应用。随着百草枯的广泛使用,近年来由百草枯引起的中毒病例不断增多。百草枯对人的毒性极大,肺组织是其作用的主要靶器官,目前临床上尚无特效药物治疗,中毒死亡率可达50-90%。虽然近年来对百草枯的中毒机制进行了大量研究,但目前尚未完全阐明。因而研究百草枯致机体损伤的机制,对于有效的预防和治疗百草枯中毒具有重要的现实意义。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是n-3系列多不饱和脂肪酸(n-3polyunsaturated fatty acids, n-3PUFA),主要是从鱼油或者微藻油中提炼的。早期的研究表明,DHA对神经系统发育具有重要作用,并对心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化等起到较好的治疗效果。新近的研究显示,DHA具有明显的抗炎抗氧化作用,并在一定程度上减轻人类的一些纤维病变。早期的急性炎症和后期的肺纤维化是百草枯中毒死亡的主要原因,因此我们推测DHA可能具有拮抗百草枯诱导的肺损伤的作用。为研究DHA对百草枯中毒的拮抗作用,本研究采用一次性经口给予雄性昆明小鼠50mg/kg.bw PQ建立急性肺损伤模型,从动物死亡情况、氧化抗氧化系统等方面观察DHA拮抗百草枯引起的急性肺损伤的作用；采用一次性经口给予雄性wistar大鼠50mg/kg.bw PQ染毒,建立百草枯肺纤维化模型,通过测定肺组织中胶原纤维蛋白含量及肺组织病理改变,观察DHA对百草枯引起的肺纤维化的拮抗作用,通过检测肺组织纤维化过程中的两个重要调控因子Smad7、SnoN的蛋白水平的变化初步探讨百草枯引起肺纤维化的中毒机制。研究方法1.急性肺损伤模型的建立及指标测定SPF级雄性昆明种小鼠适应性喂养5天后,随机分为正常对照组、模型组和DHA干预组,每组24只。DHA干预组动物每天经灌胃给予500mg/kg.bw的DHA；正常对照组、模型组动物每天给予等体积的玉米油灌胃。在给予DHA的第8天,PQ经生理盐水稀释后,模型组和DHA干预组动物经灌胃一次性给予50mg/kg.bw PQ染毒,正常对照组给予等体积生理盐水。PQ染毒后,持续给予DHA,观察记录各组动物死亡情况,于染毒7天后20%乌拉坦腹腔注射麻醉动物,取肺组织进行各指标测定。观察PQ染毒后各组小鼠的死亡情况,比较各组小鼠的肺脏系数,采用生化法测定小鼠肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、还原性谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量；Western blotting测定小鼠肺组织中4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal,4-HNE)和MDA蛋白加合物水平的变化。2.肺纤维化模型的建立及指标测定SPF级雄性Wistar大鼠,体重200-220g,适应性饲养5天,随机分为正常对照组、模型组、DHA干预组和DHA对照组,每组10只。DHA干预组和DHA对照组每天一次分别给予500mg/kw.bw的DHA灌胃,正常对照组、模型组给予等体积玉米油。给予DHA的第8天,PQ用生理盐水稀释后,经灌胃分别给予模型组、DHA干预组动物50mg/kg.bw的PQ一次性染毒,等体积生理盐水分别给予正常对照组和DHA对照组。PQ染毒后,各组动物持续给予DHA,于染毒后第35天,处死动物。苏木素-伊红(HE)染色法观察肺组织病理学改变,Masson染色法、湿重/干重比值(wet-to-dry weight ratio, W/D)观察肺组织纤维化程度；肺组织中羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量采用碱水解法测定；采用SABC免疫组织化学法、Western blotting测定大鼠肺组织中Smad7、SnoN蛋白水平的变化。研究结果1.DHA对百草枯诱导急性肺损伤的拮抗作用1.1DHA对PQ诱导小鼠急性肺损伤致死亡的影响模型组和DHA干预组经灌胃一次性给予PQ7天后,模型组小鼠死亡率为58.3%,DHA干预组小鼠死亡率为33.3%,差异有统计学意义(P<0.05),说明DHA能显著降低PQ诱导小鼠急性肺损伤导致的死亡1.2DHA对PQ诱导小鼠肺脏器系数的影响PQ染毒7天后,肉眼解剖观察,正常对照组小鼠肺组织呈粉红色,无充血、水肿现象；模型组动物肺组织表面色泽暗红,充血、水肿明显,体积明显增大,包膜下可见点状、片状出血,切面疏松,有淡红色液体溢出；DHA干预组动物肺组织较模型组动物损伤明显减轻,轻度充血、水肿,有散在包膜下出血。正常对照组肺脏器系数为(0.574±0.085)%,PQ诱导肺损伤后,模型组的肺脏器系数为(1.021±0.683)%,DHA干预组为(0.710±0.20)%,与正常对照组相比,模型组肺脏器系数增加了77.87%(P<0.01)；提前1周给予DHA干预,可明显降低PQ诱导的肺充血水肿和炎性变化,与模型组相比,两者差异有统计学意义(P<0.05)。1.3DHA对PQ诱导急性肺损伤肺组织中MPP、MDA及GSH含量的影响与正常对照组相比,模型组动物肺组织中的MPO含量增加了20.6%(P<0.01)；DHA干预组肺组织中的MPO含量明显低于模型组(P<0.05),与正常对照组无明显差别。模型组小鼠给予PQ后肺组织中脂质过氧化反应明显增强。与正常对照组相比,模型组肺组织中MDA含量增加了21.7%(P<0.01)；DHA干预组比模型组减少了14.4%(P<0.01),说明提前给予7天DHA能够有效抑制肺组织中MDA水平的增加(P<0.01)PQ摄入7天后,与正常对照组相比,模型组动物肺组织中GSH水平下降了14.2%(P<0.01),与模型组相比,DHA干预组GSH水平显著增加(P<0.05),与正常对照组差别不明显(P>0.05)。1.4DHA对PQ诱导急性肺损伤肺组织中4-HNE、MDA蛋白加合物水平的影响Western blotting的结果显示,与正常对照组比较,模型组小鼠肺组织中4-HNE蛋白加合物表达水平增加了43.97%(P<0.05),而提前给予DHA干预后,小鼠肺组织中的4-HNE蛋白加合物表达水平仅增加了3.16%,比模型组显著减少(P<0.05)；与正常对照组比较,模型组小鼠肺组织中MDA蛋白加合物表达水平增加了42.39%(P<0.05),提前给予DHA干预后,小鼠肺组织中的MDA蛋白加合物表达水平增加了16.97%,DHA对照组与正常对照组均无明显差别(P>0.05)。说明提前给予DHA干预能够有效降低PQ引起的肺组织的氧化应激。2.DHA对百草枯引起的肺纤维化的拮抗作用2.1动物体重及一般情况观察模型组动物给予PQ染毒后,皮毛蓬松,毛色暗淡,精神萎靡,进食、进水量减少,行动迟缓。染毒后体重增长减慢,28天后体重明显低于正常对照组(P<0.05),DHA干预组、DHA对照组体重与正常对照组无明显差别。2.2肺组织HE染色各组动物肺组织经HE染色后,光镜下观察可见,正常对照组肺泡结构清晰,壁薄,肺泡腔内无炎性细胞浸润；模型组肺组织间隔增厚变宽,肺泡腔明显狭窄,伴局灶性肺不张；DHA干预组动物肺泡壁无明显增厚,结构清晰,病变不明显；DHA对照组与正常对照组无明显差别。2.3肺组织纤维化改变2.3.1W/D比值PQ模型组的W/D明显小于正常对照组(P<0.05),与模型组相比,DHA干预组与DHA对照组W/D均显著增大(P<0.05),与正常对照组无显著差别。2.3.2肺组织中羟脯氨酸含量PQ染毒35天后,与正常对照组相比,模型组肺组织中的羟脯氨酸含量增加了18.3%(P<0.05)；DHA干预组及DHA对照组的含量与正常对照组差别不明显,但明显低于模型组(P<0.05)。2.3.3Masson染色各组肺组织经Masson染色后,光镜下观察可见,正常对照组动物肺组织结构完整,肺泡壁周围有少量蓝色胶原纤维,腔内无胶原蛋白沉积；模型组动物肺泡壁增厚明显,大量胶原蛋白沉积与肺泡壁及肺泡腔内,肺泡腔狭窄变形,部分肺泡出现实变现象；DHA干预组动物肺泡结构完整,肺泡壁周围及肺泡腔中无明显胶原蛋白沉积,无实变现象；DHA对照组与正常对照组差别不明显。2.4肺组织中Smad7和SnoN蛋白表达2.4.1免疫组织化学方法测定肺组织中Smad7和SnoN蛋白表达镜下观察可见,Smad7表达于肺泡和上皮细胞中。正常对照组Smad7阳性着色面积大且密集,模型组阳性着色面积比正常对照组明显减少,并且比较分散,DHA干预组的阳性着色面积较模型组增加,DHA对照组与对照组差别不明显；积分光密度结果显示,与正常对照组相比,模型组积分光密度降低了63%(P<0.01),与模型组相比,DHA干预组积分光密度比模型组增加了112.7%(P<0.01),DHA对照组与正常对照组差别不明显(P>0.05)。SnoN蛋白主要在肺泡中表达,正常对照组SnoN蛋白阳性着色面积密集,分布均匀,与正常对照组比较,模型组阳性着色面积明显减少,且分布不均匀,DHA干预组的阳性着色面积分布均匀,较模型组增加；与正常对照组相比,模型组积分光密度降低了41%(P<0.01),与模型组比较,DHA干预组的积分光密度比模型组增加了42.4%(P<0.01),DHA对照组与正常对照组无明显差别(P>0.05)。2.4.2Western blotting测定肺组织中Smad7和SnoN蛋白表达Western blotting的结果与免疫组化结果一致。与正常对照组比较,模型组大鼠肺组织中Smad7及SnoN蛋白表达均显著减少(P<0.05,P<0.01)；而提前给予DHA干预后,大鼠肺组织中的Smad7与SnoN蛋白表达均未明显减少,与正常对照组无显著差异(P>0.05),说明DHA能够有效抑制百草枯诱导的大鼠肺组织Smad7和SnoN表达的降低；DHA对照组与正常对照组差别不大(P>0.05)。结论1.DHA (500mg/kg.bw)可有效拮抗50mg/kg.bw PQ所致小鼠急性肺损伤。2.DHA可显著降低PQ诱导的肺脏脂质过氧化产物4-HNE、MDA蛋白加合物的产生,DHA可能通过其抗氧化活性,降低肺脏氧化应激拮抗PQ致急性肺损伤。3. DHA (500mg/kg.bw)可有效拮抗50mg/kg.bw PQ所致大鼠慢性肺纤维化。4.PQ所致的肺纤维化可能与其抑制组织纤维化过程的两个重要因子Smad7、 SnoN的蛋白表达有关,DHA可能通过上调Smad7、SnoN的表达来减轻PQ所致的肺纤维化。