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本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) CH-1R株基因组为模板,克隆了N基因核苷酸序列并进行了生物信息学分析、构建了表达载体并进行原核表达、蛋白纯化及初步建立了间接ELISA检测方法。1.N基因的克隆及生物信息学分析参照Genbank上登录号为EU807840.1的PRRSV的N基因核苷酸序列,设计并合成了一对特异性引物,以PRRSV CH-1R疫苗株为材料,TA克隆到pMD19T-Simple Vector,构建重组克隆质粒pMD-N,经酶切鉴定和序列测定,克隆出长为386 bp的基因片段,包含372 bp的N基因完整阅读框,编码123个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外不同来源的15个毒株进行生物信息学分析,与美洲型毒株的核苷酸序列同源性、氨基酸同源性分别在92.7%～95.7%、93.5%～96.0%之间,与欧洲型核苷酸序列同源性、氨基酸相似性分别在65.3%～65.9%、57.3%-58.1%。2.N蛋白原核表达及活性检测根据获得的重组质粒pMD-N和原核表达载体pET-32a(+),将N基因用EcoR I和Sal I限制性内切酶定向克隆到原核表达pET-32a(+)载体中,构建了重组质粒pET-N,将其转化原核表达菌株E.coli Rosetta TM(DE3),由IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测及Western-Blot检测,结果显示在约34kD出现目的条带,融合表达的目的蛋白以可溶性及包涵体两种形式存在,且有特异的反应原性。3.N基因重组蛋白的纯化及间接ELISA方法的初建纯化可溶性表达的重组N蛋白作为抗原,包被96孔ELISA板,同时优化抗原的包被浓度、抗体稀释倍数、酶标二抗及底物等作用条件,并通过特异性试验、重复性试验、阻断试验且与标准试剂盒对比试验,初步建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的N-ELISA方法。实验确定了ELISA最佳工作条件：重组N蛋白抗原包被浓度为13.3μg/mL,37℃1h,4℃过夜；5%脱脂奶粉,37℃封闭2h；血清1：40稀释,37℃作用90 min；酶标二抗1：4000稀释,37℃作用40 min；底物TMB溶液,室温避光显色15min；阴阳性临界值为0.434。与商业化检测PRRSV抗体的试剂盒(IDEXX)比较,本检测方法的相对特异性为93.0%、相对敏感性为95.6%，两者的符合率达94.7%，此两种方法检测结果无显著差异,结果表明该方法特异性强、重复性好、敏感度高。本研究克隆了PRRSV的N基因,并进行原核表达纯化,利用重组N蛋白建立了检测PRRSV抗体的间接N-ELISA方法。本文对N基因进行了分子生物学、生物信息学、免疫原性等方面的研究,为进一步研究PRRSV提供了参考。