背景与目的:听力障碍是人类最常见的一种感觉缺陷,其新生儿发病率约1/1000,其中有近一半病例是由遗传因素导致的遗传性耳聋。听力障碍不仅给患者的个人生活带来负面影响,而且使社会成本极大地增加。目前已发现数百个遗传性耳聋的致病基因,其中SLC26A4基因是世界范围内遗传性耳聋的第二大致病基因,能够引起综合征性耳聋Pendred综合征（Pendred syndrome）,以及非综合征性耳聋前庭导水管扩大（enlarged vestibular aqueduct）。SLC26A4基因编码产生阴离子通道蛋白Pendrin,主要表达于甲状腺、内耳与肾脏,能够转运氯离子、碘离子、碳酸氢根离子、甲酸根离子、硫氰酸根离子等。在内耳中其主要作用被认为是维持内淋巴pH稳定。SLC26A4基因存在大量突变,当突变导致Pendrin蛋白离子转运功能受损时,就会引起听力损失。SLC26A4基因的致病性突变至今已识别163个,其中c.919-2A＞G突变是中国人群中发生频率最高的,占所有SLC26A4基因致病性突变发生频率的近60%。该突变破坏了SLC26A4基因内含子7末端的3’剪接位点,使其外显子8容易被跳过,产生异常可变剪接,导致开放阅读框（ORF）移位,最终其编码蛋白功能缺陷。多种策略可以用来纠正基因RNA前体的异常可变剪接,近年来分别有一款通过纠正SMN2基因剪接来治疗脊髓性肌萎缩症的小分子药物和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASO）药物被批准上市。ASO技术已经逐渐成为一种新型药物研发平台。本研究的主要目的是研发出可以治疗c.919-2A＞G突变导致的遗传性耳聋的ASO药物。为此,我们首先探索了该突变体剪接异常的分子机制,接着系统筛选了能促进其外显子8列入的ASO,并在患者来源细胞及人源化突变小鼠模型中对候选ASO的活性进行测试。方法:构建SLC26A4 c.919-2A＞G（A-2G）突变的小基因（minigene）剪接模型,通过蛋白过表达来系统探索SR蛋白家族、hnRNP蛋白家族等剪接因子对该突变体外显子8列入的影响。通过minigene缺失与突变验证该突变体中潜在的重要剪接调控元件,并通过RNA pull down、蛋白过表达、siRNA敲低、MS2-CP体系分析其特异性结合的剪接因子。利用ASO步移法（ASO walk）筛选出促进该突变体外显子8列入效果最明显的候选ASO。收集培养c.919-2A＞G纯合突变耳聋患者外周血单个核细胞（PBMCs）,检测胆固醇连接的候选ASO促进患者突变基因外显子8列入的效果。最后利用人源化突变小鼠模型,通过内耳局部注射与皮下注射验证候选ASO纠正纯合突变小鼠体内突变基因异常剪接的效果。结果:成功构建SLC26A4 c.919-2A＞G minigene（A-2G突变体）,并发现多个剪接因子过表达能调控其外显子8的列入;在内含子8上存在一个以‘TAG’序列为核心的剪接沉默子,hnRNPA1能与其特异性结合,发挥抑制剪接的功能;筛选获得促进A-2G突变体外显子8列入的候选ASO;胆固醇连接的候选ASO能够明显促进患者来源PBMCs中突变基因外显子8的列入;在人源化纯合突变小鼠模型中皮下注射候选ASO能明显改善小鼠肝脏中突变基因的异常剪接。结论:构建了SLC26A4 A-2G突变基因的剪接模型,揭示了 A-2G突变诱导外显子8跳跃的一个重要调控机制;筛选获得了 一种可以用于后续治疗实验的候选ASO,但动物试验的剂量和给药方式仍需要探索。