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急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是心血管疾病的危重类型,其发病急、预后差、病死率高,近10余年来急性心肌梗死的死亡率呈总体上升趋势。降低AMI的死亡率需从高危人群的识别、预防到治疗、减少治疗并发症等多方位、多层次的立体防治入手。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病主要的病理生理机制,大部分的AMI是由于冠状动脉内不稳定的粥样斑块溃破,继而出血和管腔内血栓形成使管腔闭塞,心肌细胞因长时间缺血而死亡。目前AMI公认的危险因素包括高血压、吸烟、脂代谢异常、糖尿病、肥胖/超重等。随着高通量测序技术的不断发展与应用,遗传基因与疾病的研究越来越多,目前单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)已成为了医学研究多基因疾病的新一代遗传标记。脂质代谢异常是AMI的重要影响因素,与脂代谢相关的基因是否也影响AMI的易感性并未可知。AMI最关键的治疗是及时、有效的恢复心脏供血,即缺血后再灌注治疗,但是缺血后再灌注在改善心肌供血的同时伴随着一系列病理生理过程,包括氧化应激、炎症、线粒体损伤、内质网应激、细胞内钙超载,最后出现不可逆的细胞焦亡、细胞凋亡和坏死,使心肌损伤范围进一步加重。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lncRNAs),是一类长度一般在200个碱基以上,但缺乏特异性的转录并且无编码蛋白功能的RNA,在多种病理机制中发挥着重要作用。长链非编码RNAα-2-巨球蛋白反义RNA1(LncRNA alpha-2-macroglobulin antisense RNA 1,A2M-AS1),既往有研究显示心肌梗死时该基因表达下降,但是其在缺血再灌注损伤中的作用尚不清楚。基于以上背景,本研究首先选择了4个脂代谢过程中的基因位点,探讨其与AMI的相关性,旨在寻找AMI可能的易感基因或保护基因。在AMI治疗中为寻找减轻心肌缺血再灌注损伤的治疗靶点,构建了体外心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,通过测定A2M-AS1表达水平及心肌细胞活性,观察A2M-AS1对缺血再灌注损伤的影响。最后探讨A2M-AS1与IL1R2对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响及二者之间的关系,以期寻找AMI治疗后缺血再灌注损伤的可能机制及新的治疗靶点。第一部分基因多态性与急性心肌梗死的相关性研究目的:探讨基因多态性与急性心肌梗死的相关性。方法:选取2017年1月至2018年6月就诊于河北省人民医院急性ST段抬高型心肌梗死患者336例和对照人群270例。测定两组患者脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320位点、低密度脂蛋白受体基因(LDLR)rs688位点、前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因(PCSK9)rs505151位点、跨膜蛋白6超家族成员2基因(TM6SF2)rs58542926位点4个基因位点信息进行基因分型,并且对患者的一般临床资料进行收集分析。结果:1.急性心肌梗死患者中高血压史(74.1%)、糖尿病史(18.8%)、吸烟史(56.5%)分布比例高于对照组(P<0.001),LDL(3.07±0.79)mmol/L、TG(1.69±1.11)mmol/L、Apo A1(1.26±0.27)mmol/L、血糖(6.89±2.75)mmol/L均高于对照组,HDL(1.12±0.25)mmol/L低于对照组,差异具有统计学意义。2.LPL rs320 T/G与GG/(GT+TT);LDLR rs688 C/T、CC/CT/TT与TT/(CC+TC);TM6SF2 rs58542926 T/C与TT/TC/CC在对照组和病例组中均存在明显差异(P<0.05)3.rs320位点上GG、GA患者甘油三酯高于AA型(P<0.05,见表7)、rs58542926位点上CT、TT基因型患者APOB/APOA1比值低于野生型CC组(P<0.05)。4.加性模型分析rs58542926 TT/CC与AMI显著相关,OR=0.098(P<0.05,OR=0.098,95%CI为0.024-0.392),是AMI的保护因素。小结:1.rs320、rs688、rs58542926等位基因频率在病例组和对照组有显著差异,其中rs320、rs688隐性模型基因型在两组中的分布具有明显差异。2.rs320不同基因型中的甘油三酯水平、rs58542926不同基因型中APOB/APOA1比值存在明显差异。3.rs58542926 TT基因型与AMI显著相关,可降低急性心肌梗死风险,为保护性基因型。第二部分长链非编码RNA A2M-AS1在缺氧/复氧心肌细胞中的表达目的:研究A2M-AS1在H/R模型心肌损伤细胞中的表达水平并通过si RNA转染与质粒载体的方式下调或者上调A2M-AS1表达。方法:1.应用人类新生儿心肌细胞构建体外缺氧/复氧(H/R)模型模拟心肌细胞缺血再灌注,通过q RT-PCR检测心肌细胞中A2M-AS1表达水平。2.选用si-A2M-AS1、pc DNA3.1-A2M-AS1对心肌细胞进行转染使A2M-AS1低表达或者过表达,并通过q RT-PCR检测转染细胞中A2M-AS1相对表达水平。3.将细胞分为五组:(1)对照组(Control group):H/R处理后未转染处理组;(2)si-con组:H/R处理后转染干扰序列对照组;(3)si-A2M-AS1:H/R处理后转染干扰序列组;(4)vector(pc DNA3.1):H/R处理后转染载体对照组细胞;(5)A2M-AS1:H/R处理后转染过表达组,采用CCK-8法检测心肌细胞活力。结果:1.与未经过缺氧/复氧的对照组相比,H/R处理后A2M-AS1表达明显降低(P<0.01)。2.在H/R模型细胞中采用小干扰RNA si-A2M-AS1下调A2M-AS1表达,质粒载体DNA3.1-A2M-AS1上调A2M-AS1表达。通过q RT-PCR分别检测A2M-AS1的表达结果显示转染si-A2M-AS1后,A2M-AS1的相对表达量明显低于si-con组,而转染pc DNA 3.1-A2M-AS1后,A2M-AS1的表达量明显高于pc DNA3.1载体组(P<0.01)。3.过表达A2M-AS1与空载体或未处理的心肌细胞相比,光密度(OD)值提高(P<0.01)。与干扰对照组或未处理的心肌细胞相比,下调A2M-AS1表达显著降低了OD值(P<0.01)。小结:1.A2M-AS1在H/R处理后的心肌细胞中表达下降。2.在H/R模型细胞中采用si RNA干扰A2M-AS1表达,pc DNA3.1上调A2M-AS1表达。通过q RT-PCR分别检测A2M-AS1的表达,成功构建了A2M-AS1过表达或抑制表达的H/R模型。3.抑制A2M-AS1表达可进一步降低H/R处理后的心肌细胞活力,而过表达A2M-AS1后细胞活力明显升高,初步证实了A2M-AS1在心肌细胞H/R损伤中具有正向保护作用。第三部分长链非编码RNA A2M-AS1与IL1R2对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响目的:探讨A2M-AS1与IL1R2对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响及二者之间的关系。方法:1.按照前一部分实验方法完成细胞转染,将过表达部分按如下验分组:(1)对照组(Control group):未经处理细胞;(2)H/R:细胞经过H/R处理;(3)H/R+A2M-AS1:细胞经过H/R处理后转染A2M-AS1组;(4)H/R+A2M-AS1+IL1R2:细胞经过H/R处理后同时转染A2M-AS1和IL1R2。低表达部分实验分组如下:(1)对照组(Control group):未经处理细胞;(2)H/R:细胞经过H/R处理;(3)H/R+si-A2M-AS1:细胞经过H/R处理后转染干扰A2M-AS1序列组;(4)H/R+si-A2M-AS1+si-IL1R2:细胞经过H/R处理后同时转染干扰A2M-AS1和IL1R2序列。2.分别应用q RT-PCR和Western Blot测定各组细胞中IL1R2表达含量。3.应用CCK-8试剂盒检测过表达/低表达各组细胞活力。4.应用流式细胞术分析检测实验各组细胞凋亡率。结果:1.H/R处理后的细胞中IL1R2的mRNA和蛋白表达较对照组明显升高(P<0.01)。与H/R组细胞相比,敲除A2M-AS1后IL1R2表达水平进一步升高,而同时敲除A2M-AS1和IL1R2基因后的心肌细胞中IL1R2的mRNA表达显著降低,两组差值具有统计学意义(P<0.01)。相反,A2M-AS1表达上调后IL1R2的mRNA表达水平显著低于H/R组(P<0.01)。在H/R+A2M-AS1组中加入pc DNA3.1-IL1R2后,即细胞中A2M-AS1与IL1R2基因同时过表达时,IL1R2的mRNA表达水平明显高于H/R+A2M-AS1组(P<0.01)。2.与对照组相比,H/R处理后细胞活力明显降低,过表达A2M-AS1基因(H/R+A2M-AS1组)细胞活力增加(P<0.01),而敲除A2M-AS1后细胞活力降至最低水平。当同时过表达A2M-AS1与IL1R2(H/R+A2M-AS1+IL1R2组)OD值明显低于H/R+A2M-AS1组(P<0.01)。在H/R模型中,同时敲除IL1R2和A2M-AS1基因(H/R+si-A2M-AS1+si-IL1R2)组的细胞存活率明显高于只敲除A2M-AS1基因(H/R+si-A2M-AS1组)组(P<0.01)。3.流式细胞术显示,与对照组相比(5.34±2.06),H/R处理后心肌细胞凋亡率升高(12.64±1.38,P<0.01)。过表达A2M-AS1基因后心肌细胞凋亡发生率下降(6.11±2.19,P<0.01),而敲除A2M-AS1基因后凋亡率明显升高(25.94±2.20,P<0.01)。与单纯过表达A2M-AS1基因相比(6.11±2.19),同时过表达A2M-AS1和IL1R2基因细胞凋亡比例增加了2倍(13.07±1.36,P<0.01)。同样,敲除A2M-AS1基因后细胞凋亡率(25.94±2.20)明显高于H/R组(12.64±1.38,P<0.01)和H/R+si-A2M-AS1+si-IL1R2组(12.52±1.05,P<0.01)。小结:1.在H/R处理后的心肌细胞中A2M-AS1与IL1R2的表达呈负相关。2.A2M-AS1可能通过负向调节IL1R2抑制H/R损伤中心肌细胞凋亡,提高细胞活力。结论:1.rs58542926与AMI显著相关,其中TT基因型可降低急性心肌梗死风险,为保护性基因型。2.A2M-AS1在H/R处理后的心肌细胞中表达下降。3.A2M-AS1对H/R损伤的心肌细胞具有正向保护作用。4.在H/R处理后的心肌细胞中A2M-AS1与IL1R2的表达呈负相关。5.A2M-AS1可能通过负向调节IL1R2抑制H/R损伤中心肌细胞凋亡,提高细胞活力。