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谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)由于其显著的优点被广泛应用于氨基酸工业。随着对其表达系统的不断研究,越来越多的外源蛋白以C.glutamicum作为宿主进行表达,但仍存在表达载体较少、表达效率低等缺点,限制了C.glutamicum表达系统的应用。本文以一株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum CGMCC 1.15647,C.glutamicum BZH001)为研究模型,对外源蛋白表达过程中涉及的关键能量利用相关基因进行了挖掘和功能研究。在不同溶解氧(Dissolved Oxygen,DO)条件(0%、30%及50%)下分别对野生菌C.glutamicum BZH001和由C.glutamicum BZH001改造的工程菌C.glutamicum eGFP进行发酵罐水平研究,通过转录组和代谢分析深入解析了不同DO条件对外源蛋白表达过程中细胞转录组和代谢水平的影响以及工程菌外源蛋白表达过程中的转录和代谢相较于野生菌的差别,为研究C.glutamicum中外源蛋白表达的影响因素奠定了理论基础。在此基础上结合多变元分析方法(Multivariate Data Analysis,MVDA),挖掘出3个影响外源蛋白表达并与能量代谢相关的基因,为C.glutamicum宿主细胞优化提供了新的遗传改造位点。通过基因过表达和敲除、重要生理代谢参数测定、相关基因表达模式分析,揭示了NCgl0909、NCgl2632、NCgl1522基因在外源蛋白表达过程中的重要作用及其调控机制,不仅为优化C.glutamicum表达系统提供了新的宿主细胞,也为建立影响外源蛋白表达的关键基因调控网络积累了重要资料。主要研究结论分为如下四个方面进行阐述:1)发酵罐水平不同DO对C.glutamicum BZH001转录组及代谢的影响。C.glutamicum BZH001在0%、30%及50%DO水平下代谢及转录组分析结果表明,30%和50%的DO水平对野生菌的影响较小;0%DO条件下菌体生长受抑制,ATP在此条件下含量最低,电子传递链受到抑制,为了使细胞内氧化还原水平保持平衡并且产生更多的ATP,导致底物水平的磷酸化增强,葡萄糖消耗增加,TCA溢流:首先丙酮酸脱氢酶复合体酶活降低;其次半胱氨酸、精氨酸和谷氨酸含量的增加也促进了TCA溢流;最后低溶解氧条件下苹果酸合酶基因表达水平(NCgl2247)上调,从而促进了乙醛酸途径的增强也促进了TCA溢流,乙醛酸途径为TCA循环提供了更多的苹果酸从而增加了草酰乙酸的含量,减少了TCA还原臂碳流量,减少了NADH的积累,促进了氧化还原平衡。转录组水平显示核糖体和氧化磷酸化途径为差异表达基因富集最大的两个途径。2)DO及外源蛋白表达双重胁迫下C.glutamicum转录组及代谢变化。分析C.glutamicum eGFP在0%、30%及50%DO水平下代谢及转录组,发现在低DO条件对C.glutamicum eGFP影响最大,为了保证在低溶解氧下细胞能够通过代谢提供足够的能量用于生命活动,并且维持细胞内还原力的平衡,低DO条件下代谢发生迁移。碳代谢方面,糖酵解途径下调,糖酵解和TCA均出现碳溢流:乳酸、乙醛酸和乙酸增加,缬氨酸,亮氨酸、异亮氨酸合成途径下调。能量代谢方面,低DO条件下细胞处于还原态,为了维持胞内氧化还原水平,TCA还原臂通量降低,乙醛酸途径增加,其他电子供体反应活性增加。电子传递链基因上调,胞内ATP浓度及eGFP产量均低于高DO水平。物质运输方面,低DO时PTS系统葡萄糖家族转运下调,而ABC转运体中谷氨酸转运蛋白GluB、GluA表达下调。转录组显示不同DO条件下C.glutamicum eGFP的主要差异基因富集在氨基酸运输和代谢、碳水化合物运输和代谢、能量代谢、细胞功能有关的信号传导和修复相关功能。3)C.glutamicum表达系统能量利用相关基因的挖掘。对比了30%DO条件下发酵罐中C.glutamicum eGFP和C.glutamicum BZH001转录组数据和代谢变化,研究C.glutamicum eGFP表达外源蛋白时代谢和基因表达水平的变化,发现在eGFP表达时出现了与低氧胁迫相似的代谢变化。外源蛋白的表达使大多数蛋白合成、分泌和调控相关的核糖体蛋白基因表达水平下调,而与蛋白分泌相关的Sec途径相关基因表达水平上调,与糖代谢相关转录调控因子表达水平上调。进一步对代谢数据和转录组数据进行多变元分析。通过多变元分析方法对eGFP在C.glutamicum中表达的转录水平的表达量(RPKM)进行相关性分析,通过OPLS-DA找出与外源蛋白表达具有相关性的59个基因,并通过跟差异表达基因的对比,鉴定3个关键基因,为外源蛋白表达的关键途径的探索和改造提供了新的研究靶点。此外我们又通过对不同时间点两种菌株细胞内外代谢物进行同样的多变元分析,找出了ATP、谷氨酸、乙酸、Glu-in、甲硫氨酸、乳酸等与外源蛋白表达相关的代谢物。4)影响外源蛋白表达并与能量代谢相关基因的功能验证。通过转录组和多变元分析数据综合分析得到三个外源蛋白表达时与能量代谢相关基因(NCgl0909、NCgl2632、NCgl1522)。在C.glutamicum BZH001中对这些基因进行过表达和敲除实验,初步分析基因的功能,探讨了这些基因对外源蛋白表达的影响和在代谢调控中的作用,并通过三个基因的相关基因在野生、过表达和敲除菌株中的表达模式,初步探讨了它们影响外源蛋白表达的调控机制。最后通过α-淀粉酶和ScFv的表达进一步验证了这三个基因对外源蛋白表达的影响,为构建一株高效表达外源蛋白的C.glutamicum宿主奠定了基础。