【摘 要】
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背景:在全球癌症报告中,结肠癌的发病率和死亡率分别位居第三和第二位,治疗结肠癌成为医疗工作者的当下要务。虽然现有抗癌药物种类较多,但普遍存在毒副作用强,易耐药的特点,所以研发出更高疗效,更低毒的新型抗结肠癌的药物是急需解决的一个医疗问题。由于微管在有丝分裂中的重要作用,微管蛋白抑制剂已经成为一种有效的抗肿瘤药物,被广泛研究。实验目的:本课题选用新型微管蛋白抑制剂TH320为实验药物,探究其对结肠癌
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背景:在全球癌症报告中,结肠癌的发病率和死亡率分别位居第三和第二位,治疗结肠癌成为医疗工作者的当下要务。虽然现有抗癌药物种类较多,但普遍存在毒副作用强,易耐药的特点,所以研发出更高疗效,更低毒的新型抗结肠癌的药物是急需解决的一个医疗问题。由于微管在有丝分裂中的重要作用,微管蛋白抑制剂已经成为一种有效的抗肿瘤药物,被广泛研究。实验目的:本课题选用新型微管蛋白抑制剂TH320为实验药物,探究其对结肠癌HT-29细胞的抑制增殖作用以及机制。实验方法:采用MTT法筛选出对TH320最敏感的肿瘤细胞,并研究其生长抑制作用规律,选择最佳浓度及最适时间用于机制探究。倒置荧光显微镜观察并拍照记录经过TH320处理后HT-29细胞形态变化,并且用Hoechst33342染料染色观察细胞核变化,采用C11BODIPY,DCFH-DA和DHE染色观察活性氧和脂质过氧化变化。同时使用流式细胞仪检测HT-29细胞经TH320诱导后的活性氧,脂质过氧化,自噬,凋亡,周期变化情况。通过Western blot实验从蛋白水平验证TH320对HT-29细胞内自噬相关蛋白（ATG5,ATG7,LC3）的表达以及周期相关蛋白（Cyclin B1,CDK1,p-H3）的表达。通过脂质氧化检测试剂盒,总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒,组织铁测定试剂盒,GSSG和GSH检测试剂盒,分别对丙二醛,总谷胱甘肽过氧化物酶活力,游离铁,GSSG和GSH含量进行检测。通过加入铁死亡抑制剂,自噬抑制剂,CDK抑制剂以探讨铁死亡,自噬以及周期阻滞之间的关系。实验结果:1.TH320对多种肿瘤细胞具有毒性作用,其中对HT-29细胞的细胞毒性作用最为明显,且强于CA-4。2.TH320对HT-29细胞的毒性作用呈时间剂量依赖性。3.TH320引起HT-29细胞发生铁死亡,而不是凋亡。4.TH320引起HT-29细胞内发生脂质过氧化即活性氧含量以及过氧化脂质含量升高,丙二醛含量升高以及总谷胱甘肽过氧化物酶活力降低,谷胱甘肽总含量降低。5.TH320诱导HT-29细胞发生自噬。6.TH320呈时间剂量依赖性地诱导HT-29细胞发生G2/M期周期阻滞。7.铁死亡抑制剂能逆转TH320对HT-29细胞的生长抑制,铁死亡,以及周期阻滞,但对TH320诱导HT-29细胞发生的自噬影响无法判断。8.自噬抑制剂能抑制TH320诱导HT-29细胞发生的自噬,但不能逆转TH320对HT-29细胞的生长抑制,铁死亡以及周期阻滞。9.CDK抑制剂能逆转TH320对HT-29细胞的生长抑制,铁死亡,以及周期阻滞,但无法确定对TH320诱导HT-29细胞发生的自噬的影响。实验结论:新型微管蛋白抑制剂TH320对人结肠癌HT-29细胞具有毒性作用,且呈时间剂量依赖性。在TH320诱导HT-29细胞死亡过程中,自噬,铁死亡,周期阻滞均参与其中;且周期阻滞与铁死亡有密切的联系,自噬与周期阻滞和铁死亡二者的关系有待进一步探究。
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