论文部分内容阅读
蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是一种具有高致死率和高致残率特点的脑血管疾病。小胶质细胞作为中枢神经系统的(Central Nervous System,CNS)固有免疫细胞,在SAH后通过释放多种炎症因子参与炎症反应,因此,调节活化小胶质细胞介导的神经炎症成为SAH的潜在治疗策略。最新研究表明,骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)在SAH后可以调节小胶质细胞活化、抑制炎症因子的产生,因此对SAH具有潜在治疗作用。然而,BM-MSCs在SAH后调节小胶质细胞活化的具体机制尚不明确。因此,本研究采用氧合血红蛋白(Oxyhemoglobin,OxyHb)刺激小鼠来源的BV2小胶质细胞模拟SAH体外模型。第一部分研究BM-MSCs对OxyHb诱导的BV2小胶质细胞活化的影响;第二部分探索BM-MSCs调节OxyHb诱导的BV2小胶质细胞活化的具体机制。为BM-MSCs在将来SAH治疗的临床转化提供实验依据。一.BM-MSCs对OxyHb诱导的BV2小胶质细胞活化的影响研究目的:证明BM-MSCs对OxyHb诱导的BV2小胶质细胞活化具有调节作用。方法:1.用10μM浓度的OxyHb刺激BV2细胞不同的时间点,检测NO释放量并确定NO释放量最大时间点,作为后续OxyHb刺激BV2细胞时间;2.将BV2细胞分成对照组(control)、氧合血红蛋白刺激组(OxyHb)和骨髓间充质干细胞共培养组(OxyHb+BM-MSCs),OxyHb组和OxyHb+BM-MSCs组分别予以10μM浓度的OxyHb刺激,control组予以等量正常培养基培养相同时间,以形态学观察结合qRT-PCR、WB、免疫荧光等技术明确BM-MSCs在OxyHb诱导的BV2小胶质细胞活化中的作用。结果:OxyHb刺激BV2细胞24h,NO释放量最大(P<0.001);与OxyHb组对比,OxyHb+BM-MSCs组NO产生减少(P<0.001);qRT-PCR提示OxyHb+BM-MSCs组炎症因子TNF-α、IL-1β和M1型小胶质细胞标记物CD16、CD32、iNOS、CD80、CD86表达较OxyHb组下调,相反抗炎因子IL-10则上调(P<0.01),而IL-6和M2型小胶细胞标记物CD206、Arg-1、TGF-β无明显变化(P>0.05);WB结果表明,OxyHb+BM-MSCs组M1型小胶细胞标记物CD16、CD86表达较OxyHb组下调(P<0.001),M2型小胶细胞标记物Arg-1、CD206无明显变化(P>0.05);免疫荧光结果提示OxyHb+BM-MSCs组M1型小胶标记物CD16/32表达较OxyHb组降低(P<0.01),M2型小胶标记物CD206无明显差异(P>0.05)。结论:BM-MSCs对OxyHb诱导的BV2小胶质细胞M1型活化具有调节作用。二.BM-MSCs调节Oxy Hb诱导的BV2小胶质细胞活化的机制探索目的:探索BM-MSCs调节Oxy Hb诱导的BV2小胶质细胞活化的机制。方法:将BV2小胶质细胞分成control、Oxy Hb和Oxy Hb+BM-MSCs三组,Oxy Hb和Oxy Hb+BM-MSCs组分别予以10μM浓度的Oxy Hb刺激24h,control组予以等量培养基培养相同时间,收集细胞建库进行RNA-seq。结果:DEGs(Differential Expressed Genes)的GO富集结果揭示BM-MSCs主要调节BV2细胞内的细胞成分及信号转导;DEGs在Fox O、TNF以及PI3K-Akt等炎症相关信号通路中高度富集;对炎症反应相关DEGs的网络分析提示,AKT1和IL1b是炎症反应相关DEGs相互作用网络图中的重要枢纽节点;DEGs分析结果发现Oxy Hb+BM-MSCs组Kdm6b、Kdm7a、Dnmt3l-ps1、Hdac5和Setd7基因较Oxy Hb表达上调,提示可能和表观遗传调控机制相关;Oxy Hb+BM-MSCs组Kdm6b较Oxy Hb组表达显著上调。结论:DEGs在Fox O、TNF以及PI3K-Akt等炎症相关信号通路中高度富集;Kdm6b可能在BM-MSCs调节Oxy Hb诱导的BV2细胞炎症反应中起着关键作用。