基于蛋白与小分子抗氧化剂协同效应的桑椹花色苷色素稳定化研究

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桑椹花色苷提取物(MAE)富含水溶性天然色素,但其在水溶液中极易受环境因素影响而降解褪色,影响产品品质,限制了其在食品中的应用。目前对花色苷的保护手段以单一方法居多,且效果有限,而多方法联用的研究鲜有报道。蛋白具有多配体结合特性,可同时负载多种小分子活性物质,是一种优良的活性成分保护载体,这一特性为蛋白-多配体复合体系中多种组分协同发挥稳定花色苷的作用提供可能。本论文以乳清分离蛋白(WPI)为载体,构建同时负载小分子抗氧化剂和花色苷的三元复合体系,从MAE溶液的色差(ΔE)、总花色苷降解率方面探究了WPI和不同小分子抗氧化剂分别在二元、三元复合体系中对MAE稳定性的影响,并通过多种分析手段研究了蛋白-小分子抗氧化剂-花色苷体系内存在的相互作用及其对蛋白结构的改变以及与MAE稳定性之间的关联,为提高MAE等天然色素稳定性提供了理论依据和指导。首先,选取WPI、酪蛋白(CN)和大豆分离蛋白(SPI)三种蛋白,以及没食子酸(GA)、阿魏酸(FA)、迷迭香酸(RA)、咖啡酸(CA)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、芦丁(Ru)、根皮苷(Phl)、柚皮苷(Nar)和半胱氨酸(Cys)九种小分子抗氧化剂作为稳定MAE色素的材料,对它们分别在p H 6.3和p H 3.6条件下对MAE溶液颜色稳定性的保护效果做了初步筛选研究。结果表明在p H 6.3条件下WPI和四种小分子抗氧化剂(FA、Phl、Nar、Cys),以及在p H 3.6条件下WPI和六种小分子抗氧化剂(GA、FA、RA、CA、EGCG、Ru)对MAE均呈现较好的保护效果。其次,对不同浓度的WPI与0.16 mg/m L MAE构成的二元体系在80°C/2 h下进行热稳定性测试,结果表明,在p H 6.3和p H 3.6条件下,WPI抑制MAE的褪色和花色苷降解最佳添加浓度分别为1.6 mg/m L和0.16 mg/m L。随后对WPI-MAE、小分子抗氧化剂-MAE、WPI-小分子抗氧化剂-MAE所组成的二元、三元体系在80°C/2 h下进行热稳定性效果比较。p H 6.3条件下,FA稳定效果最好,最佳添加浓度为1.2 mg/m L,其三元体系与WPI-MAE、FA-MAE二元体系相比ΔE分别降低了20.9%、21.1%,总花色苷降解率分别减少了38.0%、39.3%,表现出比二元体系更加有效的稳定效果。在三元和二元体系中Cys均提高了MAE的颜色稳定性,却加速了花色苷的降解。p H 3.6条件下,Ru稳定效果最好,添加0.16 mg/m L Ru时的三元体系与WPI-MAE、Ru-MAE二元体系相比ΔE分别降低了40.0%、23.8%,总花色苷降解率分别减少了18.3%、10.6%。然后,研究了WPI-FA-MAE体系(p H 6.3)和WPI-Ru-MAE体系(p H 3.6)在40°C加速储藏过程中MAE的稳定性。结果发现,相对于二元体系,三元体系能够显著延长对MAE溶液储藏稳定性的保护效果。最后,利用荧光光谱、圆二色光谱(CD)、傅里叶红外变换光谱(FTIR)、紫外可见光谱(UV-vis spectra)、粒径分布、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等分析研究了不同体系内蛋白、小分子抗氧化剂和花色苷之间存在的相互作用。结果表明,p H 6.3条件下β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)能够与C3G、FA形成二元、三元复合物,其中C3G、FA与β-lg之间分别为疏水相互作用、静电引力,FA的存在能够增强C3G与β-lg的结合能力。C3G和FA对β-lg二级结构的影响较小,但使蛋白粒径增大。紫外可见光谱结果表明,β-lg和FA能够发挥协同作用进一步提高花色苷溶液的色度。另外,p H 3.6条件下β-lg也能够与C3G、Ru形成二元、三元复合物,其中C3G、Ru与β-lg之间分别为静电引力、氢键与范德华力。C3G和Ru能够改变β-lg的二级结构,使其变得更加开放,且蛋白颗粒粒径增大。β-lg和Ru能够同时发挥大分子络合和辅色作用,为花色苷溶液带来增色效应。SDS-PAGE结果表明以上两种体系中WPI和小分子之间共价结合作用不明显。添加蛋白和小分子抗氧化剂对花色苷在热处理和储藏过程中稳定性的协同提升效果与蛋白-小分子抗氧化剂-花色苷三元体系相互作用及所形成的复合物密切相关。此外通过紫外可见光谱和超高效液相色谱飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)分析初步推断,MAE-Cys体系在热处理中形成共价加成产物可能是其花色苷含量下降但依然保持颜色稳定的原因。
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