壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，来源十分广泛。低分子量的水溶性壳聚糖具有独特的生理活性和药用价值。本文利用微生物(Rhizopus delemar菌)脂肪酶催化降解天然高分子壳聚糖制备低分子量壳聚糖，对脂肪酶的生产条件、脂肪酶降解壳聚糖的条件及降解产物的分离与鉴定等进行研究。具体研究内容如下： 一、生物固态发酵法生产脂肪酶 利用实验室筛选的一株野生型Rhizopus delemar菌，以固态培养方式生产脂肪酶酶制剂。研究了发酵条件中的碳源、氮源、培养基含水量、温度及接种量等因素对脂肪酶产量的影响。结果表明，以农副产品黄豆饼粉为基础培养基添加淀粉为碳源、蛋白胨为氮源有利于R. delemar菌的生长及脂肪酶的合成。培养基的含水量及培养温度对根霉菌产酶有显著影响。在优化条件下，即12g豆饼粉中含1.0g淀粉和0.5g蛋白胨，培养基含水量55.6％，在28℃下接种培养48h，脂肪酶的产量最高活力达320IU/g干培养基。以蒸馏水浸提培养基，得粗酶液，经等电点沉淀、凝胶层析分离及冷冻干燥，得纯酶粉，活力为2430IU/g。 二、脂肪酶催化降解壳聚糖的条件优化 研究了反应体系的温度、pH值、底物浓度、酶量、反应时间及常见金属离子等因素对酶解反应的影响。结果表明，反应体系的温度对酶解的影响很大。脂肪酶催化降解壳聚糖的适宜温度范围是40℃～50℃，以45℃为最佳，而对温度高于或小于此温度时，壳聚糖的降解速率均呈下降趋势，45℃时的反应速率大约是20℃时速率的5倍。反应体系的pH值也对酶解反应产生很大影响，当溶液的pH值在4.5～5.5之间时，脂肪酶降解壳聚糖作用明显，以pH5.0为最适pH。在实验酶量范围内，酶量的增加使酶解反应速率加快，二者之间几乎呈线性关系，方程为y=3.86x-0.16。适当增加底物浓度，也使酶解反应加快，但从两者的双倒数图可见，R. delemar菌脂肪酶催化降解壳聚糖的反应不符合简单的一级应动力型模型，该酶不具备米氏酶特征。常见金属离子中，CU》、Mfly的加入①．02mOI／LL使壳聚糖发生絮凝，无法反应；NiV、CaZ“会使脂肪酶活力下降，是酶制剂；而Na＼k＼Fe卜、Mgh等离子基本不影响脂肪酶对壳聚糖的降解。在优化的反应条件下，壳聚糖溶液的粘度随反应时问呈现出先快速下降后慢速下降趋势，在最初的 lh内，粘度下降至原溶液粘度的 36％，6h时，粘度为原液的 8％。另外，对不同脱乙酷的壳聚糖降解研究表明，壳聚糖脱乙酚度的提高有利于降解速率的加快。三、固定化脂肪酶的制备及降解壳聚糖试验 以甲壳素微粒为载体、戊二醛为交联剂，采用吸附与交联相结合的方法固定化脂肪酶。对固定化反应的条件进行了优化，得到的最佳反应条件为：酶粉与载体的加入比为0．04：l（W／W），反应pH为6刀，交联剂戊二醛浓度为0石％，反应温度和时间分别为 40C和 6h。制得的固定化脂肪酶的活力为 40IU屹。 以制备的固定化脂肪酶作降解壳聚糖试验，并以相同酶活的游离酶作对照，结果表明，固定化酶同样能催化降解壳聚糖。在相同的反应条件下，反应sh降解产物的平均聚合度固定化酶3．8，而游离酶为3．4。对固定化酶的使用稳定性进行试验，在相同的反应体系和反应条件下，反复回收使用同一份固定化酶，作降解试验。结果显示，随着固定化酶重复使用次数的增加，其活力呈下降趋势，每使用一次催化效率平均下降7％，重复使用至9次时，催化效率约为原来的一半。四、降解产物的分离提纯及鉴定 在优化的条件下，以脂肪酶催化降解壳聚糖，跟踪测定降解产物的平均聚合度，同时用高效液相色谱（HPLC份析检验。降解反应结束后，经过滤、浓缩，用SePhadex凝胶柱层析分离，分部收集洗脱液，用DNS比色法跟踪测定还原糖浓度，并用HPLC对收集液进行纯度检验，以此判断降解产物的分离情况。合并组分相同的收集液，浓缩干燥后，做红外光谱分析鉴定。