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目的了解住院患者及体检人群肠道中携带碳青霉烯酶基因革兰阴性杆菌的存在情况，阐明碳青霉烯酶基因的流行特性，为临床抗感染治疗提供依据。
方法
1.收集广州医科大学附属第一医院住院患者粪便标本1263份、广州金域体检中心粪便体检标本750份，在含美罗培南的麦康凯培养基上分离培养耐碳青霉烯革兰阴性杆菌。
2.用多重PCR法对分离出的耐碳青霉烯革兰阴性杆菌检测12种较常见的碳青霉烯酶基因和黏菌素耐药基因mcr-1，用全长引物扩增、测序后确定亚型；用接合实验验证碳青霉烯酶基因的可转移性，并获得接合子；用琼脂稀释法对阳性菌株进行药物敏感试验。
3.对携带blaNDM基因17株菌株进行分子特性分析。用MLST和ERIC-PCR进行菌株同源性分析；用质粒图谱法分析菌株的质粒携带情况；用基于PCR的复制子分型法对质粒进行分型；对携带阳性基因的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌分别检测12种毒力基因的存在；用PCR移步法检测blaNDM的基因环境。
4.对两株同时携带多种碳青霉烯酶基因的菌株（298号和971号）进行高通量测序，用RAST分析工具对耐药基因所在的质粒进行基因组注释；用PlasmidFinder网上分析工具对质粒类型进行分析；使用ResFinder分析质粒上所携带的耐药基因，并结合BLAST和RAST注释信息对碳青霉烯酶基因的上下游环境进行分析。
5.收集分离自其他临床感染标本(痰、尿液、分泌物等)的耐碳青霉烯菌株130株，用多重PCR法对其检测12种碳青霉烯酶基因的存在，并与粪便分离株的流行情况进行比较。
结果
1.耐药菌筛查结果在1263份住院患者粪便标本中共筛选到82株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌（6.5%，82/1263）；750份体检标本中筛选到48株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌（6.4%，48/750）。
2.耐药基因检测及药敏结果多重PCR对12种较常见的碳青霉烯酶基因和mcr-1基因的检测结果显示，在分离自住院患者粪便标本的82株耐碳青霉烯菌中检测到21株菌株携带碳青霉烯酶基因（25.6%，21/82）。其中17株携带blaNDM，2株携带blaIMP，2株携带多种碳青霉烯酶基因（298号和971号）。298号同时携带blaIMP-45和blaVIM-1，971号菌株同时携带blaVIM-1、blaNDM-1和blaGES-5。此外，在17株携带blaNDM的菌株中有一株菌（850号）还同时携带黏菌素耐药基因mcr-1。在分离自体检粪便标本的48株耐碳青霉烯菌中未检出碳青霉烯酶基因。携带碳青霉烯酶基因的菌株以大肠埃希菌为主。17株携带blaNDM的菌株以及2株携带blaIMP基因的菌株均接合成功获得接合子。21株阳性菌株均表现多重耐药，对美罗培南、亚胺培南、头孢吡肟、头孢唑林、头孢曲松、阿莫西林、哌拉西林100%耐药；对阿米卡星100%敏感；对妥布霉素、替加环素、氨曲南、庆大霉素、环丙沙星均表现一定的耐药率（38.1%、14.29%、42.86%、33.33%、57.14%），接合子对部分抗菌药物的MIC有所下降。
3.17株携带blaNDM菌株的流行特征分析17株阳性菌株包括11株大肠埃希菌，4株肺炎克雷伯菌，1株弗劳地枸橼酸杆菌，1株阴沟肠杆菌。对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行MLST、ERIC-PCR和毒力因子检测。11株大肠埃希菌属于9种不同的ST型（ST167、ST410、ST3489、ST7182、ST877、ST10、ST3944、ST43、ST8674），4株肺炎克雷伯菌属于3种不同的ST型（ST147、ST171、ST3244）。ERIC-PCR显示13株阳性大肠埃希菌属于13种不同的克隆型，4株阳性肺炎克雷伯菌属于4种不同的克隆型。11株阳性大肠杆菌中有9个携带fimH基因（81.8％，9/11），两株携带blaNDM-5的肺炎克雷伯菌有一组共同的毒力基因（uge，wabG，entB）。17株携带blaNDM基因的菌株质粒图谱呈现多样性，接合子中质粒数量明显减少；质粒复制子分型结果显示共存在10种质粒不相容群（IncX3、IncFII、IncX2、IncA/C、IncHI2、IncFIB、IncY、IncX4、IncK、IncFIA），其中IncX3型质粒检出率最高（原菌株13/17，接合子11/17）。17个blaNDM基因有着相似的基因环境，上游是ISAba125序列，下游为编码博来霉素抗性蛋白的bleMBL基因。
4.两株携带多种碳青霉烯酶基因的菌株高通量测序分析298号菌株同时携带的blaIMP-45和blaVIM-1共同定位在一个大小为395kb的大质粒pVIM-298上，属于未知的质粒不相容群，质粒上同时存在另一个β-内酰胺酶基因blaOXA-1和其他耐药基因。blaIMP-45和blaVIM-1均位于Ⅰ类整合子中，相距约10kb。971号菌株中blaVIM-1和blaNDM-1共同定位于150kb的IncX3质粒pVIM-971上，blaNDM-1位于转座子结构中，blaVIM-1位于Ⅰ类整合子中，两基因相距约15kb，该质粒同时携带了其他β-内酰胺酶基因blaCTX-M-3、blaTEM-1和blaSHV-12和其他几种耐药基因。此外，在971号菌株的另一个约19kb的IncP6型质粒pGES-971上，发现另一个碳青霉烯酶基因blaGES-5,该基因位于Ⅰ类整合子中。
5.临床感染标本中碳青霉烯酶基因流行情况在临床感染标本（痰、尿液、分泌物等）中分离的130株耐碳青霉烯菌株中，有30株菌株携带碳青霉烯酶基因（23.1%，30/130），其中23株携带blaKPC-2、1株携带blaNDM-1、1株携带blaNDM-5、4株携带blaIMP-25、1株携带blaGES-5。携带阳性基因的菌株以肺炎克雷伯菌为主。
结论耐碳青霉烯菌株在住院患者和体检人群肠道中均有流行，但碳青霉烯酶基因未在体检人群中检出。携带碳青霉烯酶基因的菌株散发流行，无克隆相关性，但IncX3型质粒高流行性、类似的基因环境、多基因共同携带的流行特征提示携带碳青霉烯酶基因的菌株具有传播的高风险。临床粪便标本和其他临床感染标本（痰、尿液、分泌物等）中碳青霉烯酶基因的检出率相近（25.6%和23.1%），但前者以大肠埃希菌携带blaNDM-5为主，后者以肺炎克雷伯携带blaKPC-2为主。
方法
1.收集广州医科大学附属第一医院住院患者粪便标本1263份、广州金域体检中心粪便体检标本750份，在含美罗培南的麦康凯培养基上分离培养耐碳青霉烯革兰阴性杆菌。
2.用多重PCR法对分离出的耐碳青霉烯革兰阴性杆菌检测12种较常见的碳青霉烯酶基因和黏菌素耐药基因mcr-1，用全长引物扩增、测序后确定亚型；用接合实验验证碳青霉烯酶基因的可转移性，并获得接合子；用琼脂稀释法对阳性菌株进行药物敏感试验。
3.对携带blaNDM基因17株菌株进行分子特性分析。用MLST和ERIC-PCR进行菌株同源性分析；用质粒图谱法分析菌株的质粒携带情况；用基于PCR的复制子分型法对质粒进行分型；对携带阳性基因的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌分别检测12种毒力基因的存在；用PCR移步法检测blaNDM的基因环境。
4.对两株同时携带多种碳青霉烯酶基因的菌株（298号和971号）进行高通量测序，用RAST分析工具对耐药基因所在的质粒进行基因组注释；用PlasmidFinder网上分析工具对质粒类型进行分析；使用ResFinder分析质粒上所携带的耐药基因，并结合BLAST和RAST注释信息对碳青霉烯酶基因的上下游环境进行分析。
5.收集分离自其他临床感染标本(痰、尿液、分泌物等)的耐碳青霉烯菌株130株，用多重PCR法对其检测12种碳青霉烯酶基因的存在，并与粪便分离株的流行情况进行比较。
结果
1.耐药菌筛查结果在1263份住院患者粪便标本中共筛选到82株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌（6.5%，82/1263）；750份体检标本中筛选到48株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌（6.4%，48/750）。
2.耐药基因检测及药敏结果多重PCR对12种较常见的碳青霉烯酶基因和mcr-1基因的检测结果显示，在分离自住院患者粪便标本的82株耐碳青霉烯菌中检测到21株菌株携带碳青霉烯酶基因（25.6%，21/82）。其中17株携带blaNDM，2株携带blaIMP，2株携带多种碳青霉烯酶基因（298号和971号）。298号同时携带blaIMP-45和blaVIM-1，971号菌株同时携带blaVIM-1、blaNDM-1和blaGES-5。此外，在17株携带blaNDM的菌株中有一株菌（850号）还同时携带黏菌素耐药基因mcr-1。在分离自体检粪便标本的48株耐碳青霉烯菌中未检出碳青霉烯酶基因。携带碳青霉烯酶基因的菌株以大肠埃希菌为主。17株携带blaNDM的菌株以及2株携带blaIMP基因的菌株均接合成功获得接合子。21株阳性菌株均表现多重耐药，对美罗培南、亚胺培南、头孢吡肟、头孢唑林、头孢曲松、阿莫西林、哌拉西林100%耐药；对阿米卡星100%敏感；对妥布霉素、替加环素、氨曲南、庆大霉素、环丙沙星均表现一定的耐药率（38.1%、14.29%、42.86%、33.33%、57.14%），接合子对部分抗菌药物的MIC有所下降。
3.17株携带blaNDM菌株的流行特征分析17株阳性菌株包括11株大肠埃希菌，4株肺炎克雷伯菌，1株弗劳地枸橼酸杆菌，1株阴沟肠杆菌。对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行MLST、ERIC-PCR和毒力因子检测。11株大肠埃希菌属于9种不同的ST型（ST167、ST410、ST3489、ST7182、ST877、ST10、ST3944、ST43、ST8674），4株肺炎克雷伯菌属于3种不同的ST型（ST147、ST171、ST3244）。ERIC-PCR显示13株阳性大肠埃希菌属于13种不同的克隆型，4株阳性肺炎克雷伯菌属于4种不同的克隆型。11株阳性大肠杆菌中有9个携带fimH基因（81.8％，9/11），两株携带blaNDM-5的肺炎克雷伯菌有一组共同的毒力基因（uge，wabG，entB）。17株携带blaNDM基因的菌株质粒图谱呈现多样性，接合子中质粒数量明显减少；质粒复制子分型结果显示共存在10种质粒不相容群（IncX3、IncFII、IncX2、IncA/C、IncHI2、IncFIB、IncY、IncX4、IncK、IncFIA），其中IncX3型质粒检出率最高（原菌株13/17，接合子11/17）。17个blaNDM基因有着相似的基因环境，上游是ISAba125序列，下游为编码博来霉素抗性蛋白的bleMBL基因。
4.两株携带多种碳青霉烯酶基因的菌株高通量测序分析298号菌株同时携带的blaIMP-45和blaVIM-1共同定位在一个大小为395kb的大质粒pVIM-298上，属于未知的质粒不相容群，质粒上同时存在另一个β-内酰胺酶基因blaOXA-1和其他耐药基因。blaIMP-45和blaVIM-1均位于Ⅰ类整合子中，相距约10kb。971号菌株中blaVIM-1和blaNDM-1共同定位于150kb的IncX3质粒pVIM-971上，blaNDM-1位于转座子结构中，blaVIM-1位于Ⅰ类整合子中，两基因相距约15kb，该质粒同时携带了其他β-内酰胺酶基因blaCTX-M-3、blaTEM-1和blaSHV-12和其他几种耐药基因。此外，在971号菌株的另一个约19kb的IncP6型质粒pGES-971上，发现另一个碳青霉烯酶基因blaGES-5,该基因位于Ⅰ类整合子中。
5.临床感染标本中碳青霉烯酶基因流行情况在临床感染标本（痰、尿液、分泌物等）中分离的130株耐碳青霉烯菌株中，有30株菌株携带碳青霉烯酶基因（23.1%，30/130），其中23株携带blaKPC-2、1株携带blaNDM-1、1株携带blaNDM-5、4株携带blaIMP-25、1株携带blaGES-5。携带阳性基因的菌株以肺炎克雷伯菌为主。
结论耐碳青霉烯菌株在住院患者和体检人群肠道中均有流行，但碳青霉烯酶基因未在体检人群中检出。携带碳青霉烯酶基因的菌株散发流行，无克隆相关性，但IncX3型质粒高流行性、类似的基因环境、多基因共同携带的流行特征提示携带碳青霉烯酶基因的菌株具有传播的高风险。临床粪便标本和其他临床感染标本（痰、尿液、分泌物等）中碳青霉烯酶基因的检出率相近（25.6%和23.1%），但前者以大肠埃希菌携带blaNDM-5为主，后者以肺炎克雷伯携带blaKPC-2为主。