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仔猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单独或混合感染引起,该病对仔猪的危害较大,病死率高。自2010年冬季以来,山东省部分地区仔猪发生以腹泻为主要症状的疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。其中猪传染性胃肠炎是引起仔猪腹泻的主要病因之一,该病可造成10日龄以内的仔猪100%死亡。TGEV主要感染胃肠道引起局部组织发生病变,胃肠道黏膜免疫可以有效预防病毒感染,而口服疫苗可刺激机体产生胃肠道黏膜免疫。本实验室已经成功构建好TGEV的乳酸杆菌口服疫苗。为了解山东省仔猪病毒性腹泻病病原的感染流行情况和TGEV乳酸杆菌口服疫苗的免疫情况,本研究进行了以下几个方面的工作:1.仔猪病毒性腹泻病病原流行病学调查本研究采用RT-PCR方法对2013年10月~2014年10月从山东济南、潍坊、济宁等10个地市猪场采集的226份腹泻样品进行检测。结果显示,PEDV、TGEV与PoRV的检出率分别为34.96%、2.21%和28.76%,并且不同季节PEDV和PoRV均有感染,表明PEDV和PoRV是引起山东省仔猪腹泻的主要病因,并且山东省PoRV的检出率明显高于全国(刘云波等,2013)。规模化猪场与散养户相比,PEDV、TGEV、PoRV 3种病原的检出率明显降低,而且相对于未免疫腹泻二联苗的母猪而言,免疫后的母猪生产的仔猪发生腹泻后,该病原的检出率有所降低,表明合理的饲养环境和免疫对该病具有防控作用。2.TGEV SA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立设计针对SA基因的特异性检测引物,以实验室保存的质粒pUC-S为模板PCR扩增TGEV的SA基因,并连接到pET-30a载体上,构建了重组表达质粒,导入表达菌E.coli BL21,并进行了表达条件(IPTG浓度、温度、转速、时间)优化。结果表明,在1m M/mL的IPTG,37℃,200r/min,表达6h时SA蛋白表达量最大。经过Ni-Agarose柱纯化获得纯度较高的目的蛋白,Western blot检测表明,表达的重组SA蛋白能与TGEV阳性血清发生特异性反应,不与其他常见猪病阳性血清发生反应,说明该蛋白具有一定的反应原性。以表达的SA蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法,采用方阵滴定法确定抗体最佳稀释度是1:100,抗原的包被浓度为0.75ug/ml。3.猪传染性胃肠炎乳酸杆菌口服疫苗研究本研究将已经构建好的含有TGEV的A、D抗原位点和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014的重组真核质粒pRc/CMV2-SAD-Rep.8014电转到猪源乳酸杆菌中,口服免疫6~8周龄BALB/c小鼠,并以乳酸杆菌组和商品疫苗组作为对照。分别在免疫前、二免前、二免疫后7d、14d、21d、28d采集小鼠血液收集血清检测特异性IgG抗体、IL-4和IFN-γ,并在免疫前和免疫后每间隔2周各处死2只小鼠,取脾脏检测CD4+T和CD8+T细胞的百分率,同时收集并制备小鼠的肠液样本检测特异性SIgA抗体。检测结果显示,口服免疫组中IgG抗体、IFN-γ以及CD4+T和CD8+T细胞在淋巴细胞中的百分含量与商品疫苗组差异较小,但均明显高于乳酸杆菌对照组;IL-4只有在二免后14d含量才有所提高,其余时间变化不明显;口服免疫组14d后检测的肠液中的特异性SIgA抗体含量高于商品疫苗组,且差异显著(P<0.05)。结果表明,该口服疫苗具有一定的免疫效果,且能刺激机体产生较高的黏膜免疫抗体。