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雌激素对不同类型的细胞以及同一类型的细胞在不同条件下常表现出矛盾的效应。这一现象已被众多研究证实,但其机制目前尚未完全阐明。本研究试图通过阻断雌激素代谢关键转换酶或雌激素受体(ER),将17β-雌二醇(E2)对血管平滑肌细胞(VSMC)的作用分解为受体介导和代谢产物介导的效应,以探讨雌激素对细胞的矛盾作用的机制。第一部分雌激素对血管平滑肌细胞的双重作用实验目的观察雌激素代谢关键转换酶或ER阻断后,E2对VSMC的作用的变化。实验方法采用体外培养的3-4代雌性SD大鼠VSMC。为了分解ER效应和代谢产物效应,将细胞分为3组：①单纯雌激素(E2)组：VSMC在含有梯度浓度(0M--10-5M)E2的条件常规培养；②雌激素代谢产物阻断(ABT+E2)组：细胞先用10×106M广谱的细胞色素p450酶(CYP450酶)阻断剂1-氨基苯并三唑(ABT)孵育30min,再加入0M-10-5M E2；③ER阻断(ICI+E2)组：细胞先用10-6M ER拮抗剂ICI182,780孵育30min,再加入0M-10-5M E2。分别用细胞计数法、流式细胞术和western blot分析在上述条件下雌激素对VSMC的增殖、细胞周期、细胞衰老(SA-β-Gal阳性)及衰老相关蛋白p21表达的影响。实验结果1、E2对VSMC增殖的作用细胞计数结果显示：当剂量≤10-8M时,E2显示出温和的、呈浓度依赖性的促VSMC增殖的效应。但是当浓度>10-8M时,这种促增殖作用随E2剂量增加逐渐降低,当剂量增加到10-5M时,E2的这种促增殖作用转变为抑制作用(细胞计数显著低于对照组)。在同样的条件下,当ABT阻断CYP450酶时,E2促VSMC增殖的效应明显增强,且即使在超过10-8M时,这种促进增生效应也不降低,而是维持在一个较高的平台。如果用ICI182,780阻断ER,所有浓度的E2对VSMC均显示单纯的抑制VSMC增殖效应,且这一效应呈现浓度依赖性。2、E2对VSMC细胞周期的影响细胞周期流式细胞仪分析显示：在10-9 M到10-8M时,E2能轻微的(但是具有统计学意义)引起VSMC生长指数(RI)增高,这种促增殖作用可能是由于E2能够促使VSMC更快的从G1期进入S期(G0/G1期的细胞数下降,G2/M期的细胞数上升),当E2浓度高于10-8M时,雌激素的促增殖作用表现为自我抑制(增高的RI随着E2浓度的进一步升高反而下降),G1期细胞进入S期受阻。当CYP450酶被其阻断剂ABT阻断时,E2能显著的引起VSMC的增殖,RI在10-8M以后达到平台,自我生长的抑制作用消失。当ER被其阻断剂ICI182,780阻断后,E2表现为明显的抑制作用,RI随着浓度显著下降,G1期细胞进入S期受阻。3、E2对VSMC早衰的影响流式细胞仪分析显示：在低浓度时(109M-10-8M)有轻度的抗衰老的作用,然而当雌激素浓度超过10-8M时,却呈现浓度依赖性促进衰老的作用。当CYP450酶被其抑制剂ABT阻断以后,雌激素在所有的浓度组,均表现为抗衰老的作用。然而,当ER被其阻断剂ICI182,780阻断后,雌激素就单纯的呈现浓度依赖性的促进VSMC衰老作用。对衰老相关蛋白p21 Western blot分析也证实雌激素在不同浓度下对VSMC衰老具有双重作用。在10-8M时,E2降低p21的表达,然而在10-5M时却促进p21的表达,在这两种浓度下,ABT的预处理可以降低p21的表达,而ICI182,780的预处理可以促进p21的表达。结论1、雌激素对VSMC增殖的作用随其浓度不同而具有双重性：低于10-8M(相当于妊娠大鼠的最高血浆浓度)时,E2显示出轻微的、呈剂量依赖性的促增值效应；当超过10-8M时,此效应出现自我抑制现象,且随浓度浓度进一步升高最终转变为生长抑制效应。2、当阻断CYP450酶时,E2显示促VSMC增殖效应；且高浓度时不出现自我抑制,同时伴随衰老细胞减少,提示雌激素促VSMC增殖效应之所以出现自我抑制现象很可能是由于其代谢产物诱导VSMC早衰所至。3、如果阻断ER,所有浓度的E2对VSMC均显示单纯的抑制VSMC增殖效应、并伴随衰老细胞显著增多,这进一步说明E2诱导VSMC早衰的效应为其代谢产物所为,与ER无关。4、雌激素对VSMC的增殖的矛盾效应本质上取决于其受体介导的促增殖效应和其代谢产物介导的诱导早衰效应之间彼此消涨平衡。第二部分雌激素代谢产物诱导血管平滑肌细胞早衰的机制实验目的在第一部分实验的基础上,本部分试图进一步探讨雌激素代谢产物对VSMC的作用机制,即阐明为什么当ER被阻断时,E2会诱导VSMC早衰?实验方法体外培养的3-4代雌性SD大鼠VSMC按上述的方法分为三组并给予相应的处理。分别用液相色谱质谱联用法检测VSMC中雌激素的代谢产物(2-和4-羟基雌二醇)的变化,DCF-DA染色法定量细胞内的活性氧自由基(ROS)水平,以及单细胞凝胶电泳技术分析VSMC的DNA损伤的变化。实验结果1、雌激素代谢产物的变化液相色谱质谱联用仪分析显示：当E2浓度为10-8M时,VSMC培养物中2-羟基雌二醇和4-羟基雌二醇水平与对照组比较仅有轻度的升高。然而当E2浓度为10-5M时,这两种代谢产物显著升高。这种升高可以被提前加入的CYP450酶抑制剂ABT阻断,但不能被ER阻断剂ICI182,780抑制。2、E2对VSMC内ROS产量的影响与对照组比较,VSMC内的ROS在E2浓度为10-8M时有轻度的降低,然而,在E2浓度为10-5M时则明显升高,ER阻断剂可逆转10-8M E2导致的ROS的轻度降低,且使10-5M E2导致ROS累积进一步升高。当CYP450酶被阻断后,无论E2浓度为10-5M还是10-8M,VSMC内的ROS水平均有轻度降低。3、E2对VSMC DNA损伤的影响单细胞凝胶电泳分析显示：与对照组比较,VSMC的DNA的损伤(OTM值)在E2为10-8M时有轻度的降低,但在E2浓度为10-5M时则明显升高。ER阻断剂可逆转10-8M E2导致的OTM的轻度降低,且使10-SM E2导致OTM升高进一步上升。当CYP450酶被阻断后,无论E2浓度为10-5M还是10-8M,VSMC的OTM值均有轻度降低。结论：1、VSMC内ROS产量随E2代谢产物2-羟基雌二醇和4-羟基雌二醇的升高而累积,并诱导DNA损伤。这一过程可被CYP450酶抑制剂(但不能被ER抑制剂)阻断,提示E2代谢产物通过非ER途径导致DNA损伤、诱导VSMC早衰。2、当不超过10-8M时,E2有温和的清除ROS及减轻DNA损伤效应,且这一效应可被ER抑制剂逆转,提示生理浓度雌激素的抗VSMC早衰作用为ER所介导。