背景与目的:原发性肝癌主要由起源于肝细胞的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）、起源于肝内胆管细胞的肝内胆管细胞癌和兼具有两者病理特征的混合型肝癌组成,是我国最常见的恶性肿瘤之一。其中HCC是最主要的病理类型,其病因学包括感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）、感染丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）、酗酒、罹患代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated fatty liver disease,MAFLD）等,慢性HBV感染是我国HCC发生的最主要的病因。随着我国新生儿乙肝疫苗接种策略广泛覆盖,以及临床采用核苷类似物进行抗HBV病毒治疗方案的推广和应用,HCC的主要危险因素正在发生改变。目前,因肥胖、糖尿病和高脂肪膳食结构等因素导致的MAFLD正在迅速成为我国HCC发生的重要原因。随着核酸检测技术的应用,在一些血清乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阴性的HCC、无症状的健康献血员、甚至一些乙肝疫苗免疫接种的成年人群中,在其肝脏或外周血中能够持续检出低水平的HBVDNA,这种隐匿性HBV感染（occulthepatitisBvirusinfection,OBI）可通过输血、器官移植和母婴密切接触等方式传播HBV,是潜在的HBV传染源。一个纳入16项研究的meta分析显示,OBI 能增加 HCC 发病风险（adjusted RR=2.86,95%CI=1.59-4.13）。因此,这种OBI状态与HCC的关系需引起重视。然而,影响OBI进展为HCC的因素及发生机制目前仍不甚清楚。临床研究发现,在血清HBsAg阳性的慢性HBV感染者中,异常的代谢因素如罹患糖尿病可协同促进HCC的发生发展。但目前尚不清楚MAFLD是否、以及如何影响OBI感染者发生发展为HCC。机体代谢相关疾病的重要标志是存在神经酰胺（ceramides）的异常分布与积聚,ceramides是细胞鞘脂代谢的核心分子,由神经鞘氨醇长链碱基与不同碳链长度的脂肪酸组成,其合成以在细胞内质网（endoplasmic reticulum,ER）开始的从头合成途径为主:在限速酶丝氨酸棕榈酰转移酶（serine palmitoyltransferase,SPT）的作用下将L-丝氨酸和棕榈酰CoA缩合为3-酮基二氢鞘氨醇,再还原为二氢鞘氨醇。二氢鞘氨醇在6种神经酰胺合成酶（ceramide synthase,CERS）的作用下合成二氢神经酰胺。每种CERS同工酶对不同碳链长度的脂肪酸有不同的优先选择性和不同的组织分布（见表1）,进而合成不同脂肪酸链长度的二氢神经酰胺,最终在去饱和酶（desaturase,DES,由DEGS1编码）的作用下,合成含有不同脂肪酸链长度的多样的ceramides。肝脏细胞的ER是ceramides代谢的主要细胞器,异常产生的ceramides是刺激机体天然免疫系统的重要内源性“危险信号”,可通过激活NOD-like receptor protein 3（NLRP3）炎症小体加重糖尿病等代谢性疾病进展。肝细胞的ER既是HBV组装形成完整感染颗粒并分泌的场所,同时也是ceramides合成的主要细胞器。许多OBI的发生与HBV的PreS突变体感染有关,可导致ER功能异常。本论文分析探讨了 HBV的PreS突变体感染对肝细胞ceramides代谢的影响,以及ceramides是否会及如何影响OBI发生后HCC的发生发展和可能的机制。方法与结果:1、血清HBsAg阴性HCC患者的肝细胞储留HBsAg,含有复制活性的HBV。根据实验室前期工作,回顾分析了 1823例在国家癌症中心确诊的经组织学证实的HCC,其中血清 HBsAg（-）并 anti-HBc（+）和 anti-HCV（-）但 HBV DNA（+）的 HCC 236例。从中抽取了 35例患者的外周血和肝组织样本进行分析,包括HBV的PreS-S区序列测定,在癌组织和癌旁组织进行HBsAg免疫组织化学染色和HBsAg与肝细胞ER的共定位分析。发现上述血清HBsAg（-）的HCC患者在肝组织样本中均存在HBsAg的表达,主要在HCC癌旁的肝细胞中检测到,肝细胞ER中有HBsAg的储留,而在HCC癌组织很难检测到HBsAg的表达。HCC患者的血浆及癌旁肝组织中均可检测到具有复制活性的HBV,而在癌组织中仅检测到6/35（17%）的组织存在有复制活性的HBV。同时,部分癌旁肝细胞存在脂肪变性并伴有炎症细胞的浸润。进一步分析发现,肝组织和外周血存在的HBV,其PreS-S区编码的氨基酸序列完全一致,但不同HCC患者的序列存在差异。采用进化树的基因型别分析显示,所有样本HBV分离株均为C基因型,序列已上传至GenBank（Accession#MW422170:MW422204）。2、血清HBsAg阴性HCC患者的HBV在PreS-S区存在氨基酸序列的变异,导致HBV包膜蛋白空间构象改变。以GenBank中HBV C基因型（Accession#GU434374）为“准种”参考序列进行PreS-S区编码氨基酸比对,发现其中28条序列在HBV的PreS-S区,包括PreS1,PreS2和S区存在共180个位点的编码氨基酸突变,大部分突变改变了 HBV包膜蛋白（HBsAg）的氨基酸性质,发生了氨基酸极性和酸碱性的转变。进而采用RaptorX预测上述突变序列编码的HBsAg蛋白空间结构,观察到PreS区的突变使得HBsAg空间构象在一定程度上发生了改变。3、PreS区突变导致HBsAg储留在肝细胞ER,使CERS和DEGS1的表达增加、促进ceramides产生。为进一步研究PreS区突变对肝细胞功能的影响,从中筛选了 2条有一定代表性的PreS1突变体（E54K,V90A,G102R）和PreS2突变体（16-22delete,V32L,I42T）序列转染人肝细胞。在多种细胞系中均观察到PreS区突变造成了 HBsAg在ER的储留,引发ER应激反应。高效液相色谱-串联质谱（HP LC-MS/MS）分析细胞内ceramides含量,与未转染HBV质粒的细胞相比,转染HBV质粒的细胞中ceramides含量显著增加,尤其是转染了 PreS突变体的肝细胞。上述转染HBV质粒的肝细胞中CERS2、CERS6和DEGS1 mRNA及蛋白表达水平显著高于未转染HBV质粒的肝细胞,尤其是转染PreS突变体的肝细胞。棕榈酸处理细胞模拟脂超载,CERS2、CERS6和DEGS1转录水平以时间剂量依赖的方式增加。与未转染HBV质粒的细胞相比,C16 ceramide含量在转染HBV质粒的细胞中升高了2倍,在转染PreS突变体的细胞中升高了5倍,棕榈酸处理进一步增加了细胞内C16 ceramide产生。4、肝细胞内异常增加的ceramides在肝细胞释放的HBV蛋白共同刺激下,激活巨噬细胞的NLRP3炎症小体。用C6-ceramide和/或HBV蛋白（HBsAg和HBcAg）处理小鼠腹腔炎性巨噬细胞或用棕榈酸处理PreS突变体转染的HepG2细胞收集条件培养基继续培养小鼠腹腔炎性巨噬细胞,通过检测NLRP3炎症小体活化相关分子的表达水平。发现异常增加的ceramides在HBV蛋白共同刺激下活化了 NLRP3炎症小体,分泌大量炎性细胞因子IL-1β和IL-18。5、高脂饮食增加HBVPreS突变质粒转染小鼠肝组织ceramides产生,促进小鼠HCC进展。对2周龄雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射化学致癌剂二乙基亚硝胺（DEN）诱导肝细胞癌变,6周龄时尾静脉高压注射前述获得的2株代表性HBV PreS突变体,8周龄开始给予高脂饮食,持续5周。观察发现高脂饮协同HBV感染促进小鼠肝脏脂肪变性和炎症细胞的浸润。高脂饮食在肝细胞感染HBV,特别是感染PreS突变体后,肿瘤负荷增加,促进HCC进展。与未注射HBV质粒的小鼠相比,HBV质粒注射的小鼠肝组织C16 ceramide含量增加10倍,高脂饮食饲喂后,HBV质粒注射的小鼠肝组织C16 ceramide含量进一步增加,特别是PreS突变体质粒注射的小鼠肝组织C16 ceramide含量增加了15倍。6、抑制ceramides从头合成途径或阻断IL-1β活性延缓HCC进展。对2周龄雄性C57BL/6J背景的Alb-1HBV小鼠（HBsAg在肝细胞ER持续储留）腹腔注射DEN诱导肝细胞癌变,从8周龄开始给予高脂饮食,持续13周。部分高脂饮食小鼠腹腔注射myriocin或IL-1β中和性抗体。结果显示高脂饮食在肝组织已经存在肿瘤前体细胞或肿瘤细胞时,能够协同HBV感染加速HCC进展。肝细胞内异常增加的ceramides在肝细胞释放的HBV蛋白共同刺激下,激活肝脏浸润的巨噬细胞上NLRP3炎症小体,产生炎性细胞因子IL-1β和IL-18加重肝脏炎症。抑制ceramides从头合成或阻断IL-1β活性能够延缓HCC进展。小结:HBV的PreS突变体转染导致HBsAg在肝细胞ER的储留促进肝脏ceramides尤其是C16 ceramide的产生。异常增多的ceramides可能通过激活肝脏浸润巨噬细胞NLRP3炎症小体加重肝脏炎症,在肝脏已经出现肿瘤前体细胞或肿瘤细胞的情况下促进HCC进展。在有效的抗HBV治疗基础上,靶向ceramides的产生,尤其是C16 ceramide的产生,或阻断ceramides的作用可能是延缓HBV感染者HCC进展的有效策略。