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刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax seuticosus(Rupr.et Maxim.) Harms的干燥根、根茎及茎，又名五加参、西伯利亚参，是一种常用中药材。其性味辛、温、微苦，有益气健脾、补肾安神的功效，常用于治疗脾肺气虚，体虚乏力，肾虚腰膝酸痛，失眠多梦等。现代药理学研究表明，刺五加具有神经保护、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳等作用。由于刺五加药用价值高，药理作用广泛，导致刺五加资源消耗与日俱增，野生资源遭到破坏，市场上假药劣药较多，需对其进行质量控制。目前关于刺五加的质量控制中，多是对其1-2种主要化学成分的定量测定，无法全面表征刺五加化学成分群的整体性和复杂性，难以全面控制刺五加内在质量。在现有刺五加指纹图谱的研究中，分析方法时间长，样品产地单一，不具有很好的代表性。刺五加中药材化学成分的多样性和复杂性是其发挥疗效的物质基础，同时也是质量评价的重点与难点。有代表性的多指标成分同时测定和指纹图谱相结合，体现了中药多成分特点，整体控制中药质量，确保了其内在质量的均一、稳定。所以本研究在刺五加主要活性成分提取工艺优化的基础上，收集尽可能多的道地药材、主产地药材，同时注重指标性成分的选择，从刺五加多组分含量的同时测定和指纹图谱两方面对刺五加药材进行了较全面的质量控制，既强调对照品的专属性，含量测定采用有代表性的多指标成分同时测定，又兼顾指纹图谱能整体、宏观表征被测样品化学成分的特征，并且刺五加指纹图谱的建立选用超高效液相色谱仪，较以往的刺五加指纹图谱大大缩短了分析时间。
刺五加作为一种营养滋补类中药材，具有神经保护作用，但具体作用的有效成分尚不明确。本课题对不同产地刺五加总苷神经保护作用的关键成分进行研究，提取纯化刺五加总苷并进行含量测定，建立总苷指纹图谱，将总苷作用于PC12神经细胞病理模型，通过MTT实验测定其神经保护作用的EC50。运用灰色关联度法确定各共有峰与神经保护作用关联强度，应用偏最小二乘法和多元线性回归建立总苷指纹图谱与EC50间的谱效关系，从而筛选刺五加总苷神经保护作用的关键活性成分。
1响应曲面法优化刺五加中紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的提取工艺
通过响应曲面法优化刺五加中紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的提取工艺，以提高紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的提取率。采用超高效液相法(UPLC)测定紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的含量，在单因素考察的基础上运用Box-Behnken中心组合设计以3者含量的综合评价结果为考察指标，以提取时间、提取温度和甲醇体积分数为自变量，进行3因素3水平响应面优化设计，对实验结果进行多项式线性方程拟合，绘制响应曲面和等高线图，并对优化后的最佳提取工艺进行验证。实验结果显示模拟得到的最优条件为提取时间1.995h ，提取温度66.6℃，甲醇体积分数为72.2%，此条件下综合评价结果为4.172。为使实际操作方便，将提取条件修正为提取时间2h，提取温度67℃，甲醇体积分数为72%。验证实验结果平均综合评价为4.248，与模型预测值较为接近。经响应曲面法优化后，刺五加中紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶提取率得到提高，且该优化方法准确、可靠，操作简单。
2 UPLC法同时测定刺五加中4种主要活性成分的含量
建立超高效液相色谱法同时测定刺五加中原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含量。超高效液相选用Waters BEH C18 (2.1×100mm,1.7μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.3%冰乙酸水溶液(B)，进行梯度洗脱；检测波长原儿茶酸为 257nm，绿原酸为 324nm，紫丁香苷为 267nm，异嗪皮啶 220nm；流速 0.3mL·min-1；进样量：2μL，柱温：30℃。实验结果显示原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的线性范围分别为 3.69~59.00μg·mL-1 (R2=0.9995)、6.19~99.00μg·mL-1 (R2=0.9999)、 5.81~93.00μg·mL-1 (R2=0.9999) 、3.06~49.00μg·mL-1 (R2=0.9999)，平均回收率分别为96.53%，97.71%，100.56%，98.46%， RSD 分别为 1.16%，0.85%，0.64%，1.14%。24 批刺五加中原儿茶酸的含量范围为0.074~1.089mg·g-1，绿原酸的含量范围 2.139~16.625 mg·g-1，紫丁香苷的含量范围 0.323~2.079mg·g-1，异嗪皮啶含量范围0.168~0.786mg·g-1。该方法精密度高，重复性好，操作简单，结果准确可靠，可用于中药刺五加的质量控制。
3 不同产地刺五加药材UPLC指纹图谱的研究
建立不同产地刺五加药材的UPLC指纹图谱，为刺五加的质量控制和评价提供参考。选用Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱，在335nm检测波长下以乙腈(A)-0.3%冰乙酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，以紫丁香苷为参照物，在相同的色谱条件下测定24批不同产地刺五加药材，分别应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》和SPSS 21.0软件对24批刺五加药材进行相关分析和聚类分析。实验结果建立了刺五加的UPLC指纹图谱，24批药材中有8批相似度低于0.950，其余药材相似度在0.950~0.997之间，标定了17个共有指纹峰，4个已确认成分。聚类结果显示，24 批刺五加样品被分为4类，S1，S2，S4，S5，S8，S9，S11，S16聚为一类，S12，S15， S24聚为一类，S14单独为一类，其余样品聚为一类。该方法具有良好的精密度、重复性、稳定性，且分析时间短，专属性强，为刺五加的质量评价与控制提供科学依据。
4 刺五加总苷的提取及其UPLC指纹图谱方法的建立
对24批不同产地刺五加中总苷进行提取纯化，并采用香草醛-冰醋酸显色法进行显色反应，将显色反应后的总苷溶液于300~600nm波长范围内进行扫描，发现在540nm处有最大吸收。采用紫外分光光度法对刺五加总苷进行定量分析，结果显示刺五加总苷在0.011~0.066mg·mL-1范围内浓度与吸光度线性良好(R2=0.9993)，平均回收率为100.83%，RSD为3.15%。24 批刺五加总苷含量范围为5.161~11.407mg·g-1。该方法操作简便，重复性良好，可用于刺五加总苷的含量测定。
色谱条件为Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱，流动相：乙腈(A)-0.2%冰乙酸水溶液(B)，进行梯度洗脱，检测波长：335nm，流速：0.3mL·min-1，进样量：1μL，柱温：25℃。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》确定了11个共有峰，以3号紫丁香苷色谱峰为参照进行方法学考察。方法学验证表明精密度高，重复性好。
5 刺五加总苷对皮质酮诱导的PC12神经细胞损伤保护作用的谱效关系
建立了皮质酮诱导的PC12神经细胞损伤模型，并采用MTT法探究刺五加总苷对损伤的 PC12 细胞的保护作用，计算其 EC50。在建立不同来源刺五加总苷指纹图谱的基础上，采用损伤的PC12细胞模型，运用灰色关联度分析法和偏最小二乘法，将11个共有峰的相对峰面积与EC50进行关联，建立谱效关系。结果表明，灰色关联度排序为P6， P11，P4，P5，P2，P3，P1，P8，P7，P10，P9，其中P3为紫丁香苷。谱效方程为Y=-1.377P1+0.354P2+1.442P3-0.515P4-0.72P5-0.16P6+0.57P7+2P8+0.301P9-1.748P10-1.049P11，其中 P2，P3，P7，P8，P9与PC12细胞神经保护作用成正相关，P1，P4，P5，P6，P10，P11与PC12细胞神经保护作用成负相关。
综上所述，本研究采用UPLC法同时测定了刺五加中4种主要活性成分原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含量，并且首次建立了刺五加UPLC指纹图谱和刺五加总苷UPLC指纹图谱，且本研究的药材来源较以往更加广泛，药材产地更具有代表性，所用时间大大缩短，从多组分含量同时测定和UPLC指纹图谱两方面对刺五加药材进行了较全面的质量控制。实验采用谱效关系的方法获得了药效活性物质群，确定了刺五加总苷神经保护作用的活性成分，客观反映了药物内在质量，为刺五加药材后期创新性研究提供了重要的参考依据。
刺五加作为一种营养滋补类中药材，具有神经保护作用，但具体作用的有效成分尚不明确。本课题对不同产地刺五加总苷神经保护作用的关键成分进行研究，提取纯化刺五加总苷并进行含量测定，建立总苷指纹图谱，将总苷作用于PC12神经细胞病理模型，通过MTT实验测定其神经保护作用的EC50。运用灰色关联度法确定各共有峰与神经保护作用关联强度，应用偏最小二乘法和多元线性回归建立总苷指纹图谱与EC50间的谱效关系，从而筛选刺五加总苷神经保护作用的关键活性成分。
1响应曲面法优化刺五加中紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的提取工艺
通过响应曲面法优化刺五加中紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的提取工艺，以提高紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的提取率。采用超高效液相法(UPLC)测定紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶的含量，在单因素考察的基础上运用Box-Behnken中心组合设计以3者含量的综合评价结果为考察指标，以提取时间、提取温度和甲醇体积分数为自变量，进行3因素3水平响应面优化设计，对实验结果进行多项式线性方程拟合，绘制响应曲面和等高线图，并对优化后的最佳提取工艺进行验证。实验结果显示模拟得到的最优条件为提取时间1.995h ，提取温度66.6℃，甲醇体积分数为72.2%，此条件下综合评价结果为4.172。为使实际操作方便，将提取条件修正为提取时间2h，提取温度67℃，甲醇体积分数为72%。验证实验结果平均综合评价为4.248，与模型预测值较为接近。经响应曲面法优化后，刺五加中紫丁香苷、绿原酸和异嗪皮啶提取率得到提高，且该优化方法准确、可靠，操作简单。
2 UPLC法同时测定刺五加中4种主要活性成分的含量
建立超高效液相色谱法同时测定刺五加中原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含量。超高效液相选用Waters BEH C18 (2.1×100mm,1.7μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.3%冰乙酸水溶液(B)，进行梯度洗脱；检测波长原儿茶酸为 257nm，绿原酸为 324nm，紫丁香苷为 267nm，异嗪皮啶 220nm；流速 0.3mL·min-1；进样量：2μL，柱温：30℃。实验结果显示原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的线性范围分别为 3.69~59.00μg·mL-1 (R2=0.9995)、6.19~99.00μg·mL-1 (R2=0.9999)、 5.81~93.00μg·mL-1 (R2=0.9999) 、3.06~49.00μg·mL-1 (R2=0.9999)，平均回收率分别为96.53%，97.71%，100.56%，98.46%， RSD 分别为 1.16%，0.85%，0.64%，1.14%。24 批刺五加中原儿茶酸的含量范围为0.074~1.089mg·g-1，绿原酸的含量范围 2.139~16.625 mg·g-1，紫丁香苷的含量范围 0.323~2.079mg·g-1，异嗪皮啶含量范围0.168~0.786mg·g-1。该方法精密度高，重复性好，操作简单，结果准确可靠，可用于中药刺五加的质量控制。
3 不同产地刺五加药材UPLC指纹图谱的研究
建立不同产地刺五加药材的UPLC指纹图谱，为刺五加的质量控制和评价提供参考。选用Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱，在335nm检测波长下以乙腈(A)-0.3%冰乙酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，以紫丁香苷为参照物，在相同的色谱条件下测定24批不同产地刺五加药材，分别应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》和SPSS 21.0软件对24批刺五加药材进行相关分析和聚类分析。实验结果建立了刺五加的UPLC指纹图谱，24批药材中有8批相似度低于0.950，其余药材相似度在0.950~0.997之间，标定了17个共有指纹峰，4个已确认成分。聚类结果显示，24 批刺五加样品被分为4类，S1，S2，S4，S5，S8，S9，S11，S16聚为一类，S12，S15， S24聚为一类，S14单独为一类，其余样品聚为一类。该方法具有良好的精密度、重复性、稳定性，且分析时间短，专属性强，为刺五加的质量评价与控制提供科学依据。
4 刺五加总苷的提取及其UPLC指纹图谱方法的建立
对24批不同产地刺五加中总苷进行提取纯化，并采用香草醛-冰醋酸显色法进行显色反应，将显色反应后的总苷溶液于300~600nm波长范围内进行扫描，发现在540nm处有最大吸收。采用紫外分光光度法对刺五加总苷进行定量分析，结果显示刺五加总苷在0.011~0.066mg·mL-1范围内浓度与吸光度线性良好(R2=0.9993)，平均回收率为100.83%，RSD为3.15%。24 批刺五加总苷含量范围为5.161~11.407mg·g-1。该方法操作简便，重复性良好，可用于刺五加总苷的含量测定。
色谱条件为Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱，流动相：乙腈(A)-0.2%冰乙酸水溶液(B)，进行梯度洗脱，检测波长：335nm，流速：0.3mL·min-1，进样量：1μL，柱温：25℃。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》确定了11个共有峰，以3号紫丁香苷色谱峰为参照进行方法学考察。方法学验证表明精密度高，重复性好。
5 刺五加总苷对皮质酮诱导的PC12神经细胞损伤保护作用的谱效关系
建立了皮质酮诱导的PC12神经细胞损伤模型，并采用MTT法探究刺五加总苷对损伤的 PC12 细胞的保护作用，计算其 EC50。在建立不同来源刺五加总苷指纹图谱的基础上，采用损伤的PC12细胞模型，运用灰色关联度分析法和偏最小二乘法，将11个共有峰的相对峰面积与EC50进行关联，建立谱效关系。结果表明，灰色关联度排序为P6， P11，P4，P5，P2，P3，P1，P8，P7，P10，P9，其中P3为紫丁香苷。谱效方程为Y=-1.377P1+0.354P2+1.442P3-0.515P4-0.72P5-0.16P6+0.57P7+2P8+0.301P9-1.748P10-1.049P11，其中 P2，P3，P7，P8，P9与PC12细胞神经保护作用成正相关，P1，P4，P5，P6，P10，P11与PC12细胞神经保护作用成负相关。
综上所述，本研究采用UPLC法同时测定了刺五加中4种主要活性成分原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含量，并且首次建立了刺五加UPLC指纹图谱和刺五加总苷UPLC指纹图谱，且本研究的药材来源较以往更加广泛，药材产地更具有代表性，所用时间大大缩短，从多组分含量同时测定和UPLC指纹图谱两方面对刺五加药材进行了较全面的质量控制。实验采用谱效关系的方法获得了药效活性物质群，确定了刺五加总苷神经保护作用的活性成分，客观反映了药物内在质量，为刺五加药材后期创新性研究提供了重要的参考依据。