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奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中危害最大、最常见的疾病。金黄色葡萄球菌（金葡菌）是其最重要的一种致病菌，据报道，超过25％的临床型奶牛乳腺炎由金葡菌引起。而抗生素的大量使用，会导致细菌耐药性和超级细菌的产生，对生态环境的平衡也会造成极大危害。噬菌体是一种结构简单、广泛存在、高效安全的生物抗菌剂，具有高特异性、高裂解子代数及高环境丰度等优点。迄今为止，关于噬菌体治疗金葡菌性乳腺炎的研究较多，但对于其实际应用的生物安全性机制，以及对肠道微生态的副作用等尚未见报道。本研究将噬菌体全基因组测序与小鼠转录组分析相结合，评估了噬菌体作用于金葡菌性乳腺炎的安全性;将肠道菌群微生态与炎性因子分析相结合，探讨了噬菌体有效抑制金葡菌性乳腺炎的作用机制。旨在为噬菌体疗法在该领域的应用提供理论基础与实践依据。具体研究内容和结果如下:
(1)筛选得到一株高致病性、多重耐药的金葡菌，以其为宿主菌分离获得两株裂解性能良好、广谱性的噬菌体，并检测了相关理化性质与生物学特性。
从55份患有临床型乳腺炎的病牛奶样中分离得到34株病原菌，其中金葡菌6株(17.65％)。因金葡菌Sau-XJ-21呈现最多的抗生素耐药性与较高的致病性(半数致死量LD50为1.26×106CFU/mL)，则以其为宿主菌，筛选获得两株裂解性噬菌体vBSM-A1和vBSP-A2。利用双层平板法、CsC1密度梯度离心法、透射电子显微镜(TEM)、点板法(spot-test)、一步生长曲线构建、pH值及温度稳定性检测和体外抑菌实验等，检测了噬菌体的形态特征、宿主谱、理化性质及对病原菌的体外抑制作用，结果表明，两株噬菌体均隶属于有尾目噬菌体，亥瑞勒噬菌体科;具有广谱性，能够裂解不同来源（牛源、人源）不同区域（新疆、浙江和大连）的金葡菌;单一噬菌体及噬菌体cocktail（体积1∶1）均能有效抑制金葡菌Sau-XJ-21生长。
(2)对两株噬菌体vBSM-A1和vBSP-A2进行全基因组测序与注释，阐明二者均不含毒力基因、溶源基因及毒力转座子等，不存在基因水平转移风险，具有应用安全性。
利用Illumina Genome Analyzer测序技术对两株噬菌体进行全基因组测序;选择GeneMarkS、CGView、tRNAscan-SE、Cluster X和MEGA7.0等生物信息学软件和程序，对两株噬菌体进行全基因组分析、功能基因注释、tRNA形态结构预测与分类学地位分析;运用ExPASy、TCDB、PortScale、Signal5.0、Phyre2和Swiss-Model等生物信息学程序，对噬菌体裂解酶Lys-vBSM-A1进行一级结构分析、理化性质鉴定、功能区域预测（疏水性、跨膜区域和信号肽）、二级结构预测与结构域3-D模型构建，结果显示噬菌体vBSM-A1和噬菌体vBSP-A2均为双链线性DNA，vBSM-A1/vBSP-A2基因组全长140，654/136，528bp，GC含量为30.33％/30.45％，预测出70/77个具有实际功能的基因和4/3个tRNA编码基因;两株噬菌体Genebank ID分别为MK584893和MK656892;二者均含有同一个序列保守的裂解酶基因Lys-vBSM-A1，其大小为267aa，其表达蛋白含两个典型的活性域，位于N端的c4olkB结构域和位于C端的c4olsA结构域。
(3)评估了噬菌体混合制剂对金葡菌性小鼠乳腺炎的治疗作用;阐明了其对小鼠肠道微生态的调节与改善;考察了噬菌体经小鼠乳腺灌注的安全性影响，分析了小鼠转录组表达变化与潜在作用机制。
利用金葡菌Sau-XJ-21成功构建了小鼠乳腺炎模型，评估并确定3×104CFU/25μL为最佳攻菌浓度。探究了噬菌体cocktail对金葡菌性小鼠乳腺炎的治疗，使用Beckman Coulter DxH8000血液分析仪、点板法(spot-test)、ELISA酶联免疫吸附测定、H&E组织切片染色等仪器与方法，检测了各实验组小鼠的血液样本参数、CFU和PFU负荷、炎症因子TNF-α和IL-1β指标与小鼠乳腺组织病理学形态，结果显示噬菌体cocktail在小鼠乳腺内能有效减轻金葡菌Sau-XJ-21造成的炎症症状;小鼠肠道菌群分析结果显示，头孢噻呋钠会破坏小鼠肠道内原有的优势菌株，降低菌群丰度;而噬菌体混合制剂治疗组，能够有效改善乳腺炎导致的肠道菌群紊乱，调节肠道微生态平衡。运用Illumina HiSeq测序技术进行小鼠转录组测序，对差异表达基因GO分类与KEGG富集分析，发现相较于PBS对照组，噬菌体灌注组在一些与炎症相关的基因（如细胞凋亡、细胞聚集及抗氧化活性等）表达中，存在较明显的差异表达;同时在与炎症因子相关的一些通路（如TNF信号通路以及NF-κB信号通路等）中显示出显著富集，提示了噬菌体在小鼠体内会引发一些相关的免疫反应和炎症应答。综合小鼠形态学观察、乳腺组织病理学切片分析、炎症因子TNF-α检测，以及噬菌体负荷检测等结果，揭示了噬菌体灌注形成的炎症特征轻微，对小鼠正常生命体征无碍。
综上，本论文以致病性金葡菌为目标菌株，分离获得两株裂解性噬菌体;研究了施用噬菌体混合制剂治疗小鼠金葡菌性乳腺炎的有效性;揭示了该噬菌体混合制剂在调节小鼠肠道菌群丰度、改善肠道微生态平衡中，相较于抗生素的优越性;从全基因组、转录组、炎症因子、小鼠表观状态及乳腺噬菌体负荷等角度，初步阐明了噬菌体混合制剂的应用安全性。因此，该噬菌体混合制剂是一种能够在体外和体内均有效抑制金葡菌生长的生物安全制剂，具有较高的应用前景和可行性。
(1)筛选得到一株高致病性、多重耐药的金葡菌，以其为宿主菌分离获得两株裂解性能良好、广谱性的噬菌体，并检测了相关理化性质与生物学特性。
从55份患有临床型乳腺炎的病牛奶样中分离得到34株病原菌，其中金葡菌6株(17.65％)。因金葡菌Sau-XJ-21呈现最多的抗生素耐药性与较高的致病性(半数致死量LD50为1.26×106CFU/mL)，则以其为宿主菌，筛选获得两株裂解性噬菌体vBSM-A1和vBSP-A2。利用双层平板法、CsC1密度梯度离心法、透射电子显微镜(TEM)、点板法(spot-test)、一步生长曲线构建、pH值及温度稳定性检测和体外抑菌实验等，检测了噬菌体的形态特征、宿主谱、理化性质及对病原菌的体外抑制作用，结果表明，两株噬菌体均隶属于有尾目噬菌体，亥瑞勒噬菌体科;具有广谱性，能够裂解不同来源（牛源、人源）不同区域（新疆、浙江和大连）的金葡菌;单一噬菌体及噬菌体cocktail（体积1∶1）均能有效抑制金葡菌Sau-XJ-21生长。
(2)对两株噬菌体vBSM-A1和vBSP-A2进行全基因组测序与注释，阐明二者均不含毒力基因、溶源基因及毒力转座子等，不存在基因水平转移风险，具有应用安全性。
利用Illumina Genome Analyzer测序技术对两株噬菌体进行全基因组测序;选择GeneMarkS、CGView、tRNAscan-SE、Cluster X和MEGA7.0等生物信息学软件和程序，对两株噬菌体进行全基因组分析、功能基因注释、tRNA形态结构预测与分类学地位分析;运用ExPASy、TCDB、PortScale、Signal5.0、Phyre2和Swiss-Model等生物信息学程序，对噬菌体裂解酶Lys-vBSM-A1进行一级结构分析、理化性质鉴定、功能区域预测（疏水性、跨膜区域和信号肽）、二级结构预测与结构域3-D模型构建，结果显示噬菌体vBSM-A1和噬菌体vBSP-A2均为双链线性DNA，vBSM-A1/vBSP-A2基因组全长140，654/136，528bp，GC含量为30.33％/30.45％，预测出70/77个具有实际功能的基因和4/3个tRNA编码基因;两株噬菌体Genebank ID分别为MK584893和MK656892;二者均含有同一个序列保守的裂解酶基因Lys-vBSM-A1，其大小为267aa，其表达蛋白含两个典型的活性域，位于N端的c4olkB结构域和位于C端的c4olsA结构域。
(3)评估了噬菌体混合制剂对金葡菌性小鼠乳腺炎的治疗作用;阐明了其对小鼠肠道微生态的调节与改善;考察了噬菌体经小鼠乳腺灌注的安全性影响，分析了小鼠转录组表达变化与潜在作用机制。
利用金葡菌Sau-XJ-21成功构建了小鼠乳腺炎模型，评估并确定3×104CFU/25μL为最佳攻菌浓度。探究了噬菌体cocktail对金葡菌性小鼠乳腺炎的治疗，使用Beckman Coulter DxH8000血液分析仪、点板法(spot-test)、ELISA酶联免疫吸附测定、H&E组织切片染色等仪器与方法，检测了各实验组小鼠的血液样本参数、CFU和PFU负荷、炎症因子TNF-α和IL-1β指标与小鼠乳腺组织病理学形态，结果显示噬菌体cocktail在小鼠乳腺内能有效减轻金葡菌Sau-XJ-21造成的炎症症状;小鼠肠道菌群分析结果显示，头孢噻呋钠会破坏小鼠肠道内原有的优势菌株，降低菌群丰度;而噬菌体混合制剂治疗组，能够有效改善乳腺炎导致的肠道菌群紊乱，调节肠道微生态平衡。运用Illumina HiSeq测序技术进行小鼠转录组测序，对差异表达基因GO分类与KEGG富集分析，发现相较于PBS对照组，噬菌体灌注组在一些与炎症相关的基因（如细胞凋亡、细胞聚集及抗氧化活性等）表达中，存在较明显的差异表达;同时在与炎症因子相关的一些通路（如TNF信号通路以及NF-κB信号通路等）中显示出显著富集，提示了噬菌体在小鼠体内会引发一些相关的免疫反应和炎症应答。综合小鼠形态学观察、乳腺组织病理学切片分析、炎症因子TNF-α检测，以及噬菌体负荷检测等结果，揭示了噬菌体灌注形成的炎症特征轻微，对小鼠正常生命体征无碍。
综上，本论文以致病性金葡菌为目标菌株，分离获得两株裂解性噬菌体;研究了施用噬菌体混合制剂治疗小鼠金葡菌性乳腺炎的有效性;揭示了该噬菌体混合制剂在调节小鼠肠道菌群丰度、改善肠道微生态平衡中，相较于抗生素的优越性;从全基因组、转录组、炎症因子、小鼠表观状态及乳腺噬菌体负荷等角度，初步阐明了噬菌体混合制剂的应用安全性。因此，该噬菌体混合制剂是一种能够在体外和体内均有效抑制金葡菌生长的生物安全制剂，具有较高的应用前景和可行性。