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目的及内容: 胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)具有在体内和体外均能分化为三胚层及多种不同类型细胞的能力，获利于此种特性，对体外ESC分化机制的研究将有助于解释哺乳动物发育过程中细胞自主分化的机制和调控网络。而ESCs作为重要的心肌供体细胞来源，其向心肌向分化效率低及有限的调控研究等原因使细胞移植的临床研究、应用等受到巨大限制。此外，早期ESC分化（体外）同胚胎及胚泡形成（体内）一样，伴随着细胞增殖能力的下降和凋亡的上升，例如MAPK通路激活介导的凋亡和钙离子通道三磷酸肌醇受体IP3R3调控的钙离子释放。这些报道证明了调亡对早期发育中细胞谱系的命运决定作用。 然而，相比于已被广泛揭示的受信号通路调控的凋亡机制，表观遗传修饰尤其是组蛋白去甲基化酶对ESC分化中凋亡的调控作用，及该调控是否会影响ESCs特异的谱系分化尤其是心肌向分化的了解非常有限。因此，揭示组蛋白去甲基化酶在ESCs向心肌分化过程中的调控作用，以及其如何通过凋亡通路调控细胞的命运决定将有助于我们理解表观遗传修饰在ESC分化及凋亡中的作用，并进一步揭示分化与凋亡之间的联系。 在本论文中，我们利用稳定敲减jmjd3的mESCs系、稳定敲除phf8的mESCs系及在敲除phf8基础上构建的稳定过表达系，研究组蛋白去甲基化酶JMJD3及PHF8在mESCs向中胚层及心肌细胞分化过程中对细胞分化及细胞凋亡的作用。 方法: 本论文利用pLKO-1慢病毒载体构建jmjd3稳定敲减的mESCs系;利用同源重组技术构建phf8基因稳定敲除的mESCs系（phf8-/Y mESCs），利用pCDH慢病毒载体构建hPHF8或pmaip1稳定过表达的phf8-Y mESCs系（phf8-hPHF8-/+或phf8-pmaip1-/+ mESCs）;利用siRNA介导的基因沉默技术获得pmaip1瞬时下调的mESCs(si-Pmaip1 mESCs)，通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光、未分化状态标志基因表达等指标分析其未分化状态;利用悬滴法体外分化模型及特异诱导外胚层/内胚层分化模型，通过胚层和终末分化细胞标志基因的表达、mRNA芯片及流式分析等方法鉴定其分化能力;通过ChIP技术鉴定PHF8的靶基因并进行验证，以此来研究PHF8参与细胞凋亡及细胞命运决定的机制并探讨二者的关联。 研究结果: 1.jmjd3在mESCs向心肌细胞分化分化过程中表达水平显著上调，其缺失并不影响mESCs的自我更新但对其向中胚层及心肌细胞的分化具有至关重要的作用; 2.未分化状态的mESCs表达PHF8，但PHF8缺失并不影响mESCs多能性基因的表达水平、碱性磷酸酶活性等多能性指标，表明PHF8并不影响mESCs的自我更新; 3.PHF8在mESCs向心肌细胞分化过程中的表达水平有所变化，敲除phf8促进中胚层及随后的心肌细胞特异标志基因表达，所形成的类胚体(embryoidbodies，EBs)中心肌跳动的比例显著高于野生型，但其并不影响mESCs向早期外胚层或内胚层的分化，证明PHF8特异性的参与调控mESCs向中胚层及心肌细胞分化; 4.心肌细胞分化过程中，PHF8敲除型细胞的细胞数目显著多于野生型细胞，但无论未分化状态或分化状态，二者的BrdU染色和细胞周期水平都没有显著差异，即PHF8并不影响mESCs的增殖; 5.PHF8敲除导致的心肌细胞分化过程中凋亡水平的下调才是其细胞数目多于野生型的原因，早期凋亡指标AnnexinⅤ、晚期凋亡指标TUNEL和DNALadder等分析结果证实PHF8敲除显著下调细胞凋亡，同时，PHF8敲除显著下调心血管前体标志物FLK-1阳性细胞的凋亡比例，且这种凋亡并不依赖于Caspase-3介导的信号通路; 6.mRNA芯片分析发现促凋亡基因pmaip1在敲除型细胞的表达水平显著低于野生型，进一步ChIP实验验证pmaip1为PHF8的靶基因，且PHF8通过结合在其启动区域上、去除其上抑制基因表达的H3K9me2位点来激活其转录表达，而在特异诱导外胚层或内胚层分化的模型中PHF8敲除并不改变pmaip1的表达水平，验证PHF8特异的促进促凋亡基因pmaip1在mESCs向中胚层及心肌细胞分化过程中的表达; 7.瞬时下调pmaip1有效抑制mESC向心肌细胞分化过程中的细胞凋亡，并促进其向中胚层及心肌细胞分化; 8.phf8-/Y mESCs稳定过表达hPHF8或pmaip1均显著上调被抑制的凋亡水平，并显著下调被促进的中胚层及心肌分化，证实PHF8通过调控pmaip1表达，影响细胞凋亡从而参与mESCs向中胚层及心肌细胞的分化。 结论: 研究结果表明JMJD3敲减不影响mESCs的自我更新，但却显著下调其向中胚层及心肌细胞的分化。此外，PHF8敲除不影响mESCs的自我更新及其向外胚层或内胚层的分化，但选择性地增强中胚层及心肌细胞的分化;这种分化水平的改变是由细胞凋亡所介导的，PHF8在不影响细胞增殖的情况下，通过调控非Caspase-3依赖的促凋亡蛋白PMAIP1的表达影响分化过程中的细胞凋亡;ChIP实验进一步验证PHF8通过结合在pmaip1的启动区上，去除其上抑制基因表达的H3K9me2位点从而促进细胞凋亡，影响细胞分化;而在PHF8敲除的mESCs中过表达hPHF8或pmaip1均回复性的升高凋亡水平并降低中胚层及心肌细胞的分化效率。综上，我们首次发现PHF8在mESCs向中胚层及心肌细胞分化过程中的重要作用，并揭示其经由细胞凋亡来调控心肌相关谱系细胞命运决定的新机制。