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蛋白质分子修饰是蛋白类药物二次开发中的一项热点技术,可解决诸多蛋白类药物的应用问题,如稳定性差,半衰期短等,但修饰过程一般复杂,操作步骤多、周期长。本文以超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)为模板蛋白,探讨将分离过程和修饰过程耦合起来,从而获得活性高,稳定性更好的修饰SOD,并以此探求蛋白分离过程和修饰过程耦合的可行性。
本文首先以DEAE52为层析介质,研究了SOD阴离子交换吸附分离-PEG修饰耦合过程。研究结果表明,SOD最佳吸附条件:在pH7.8,温度25℃,溶液浓度1 mg/ml的吸附条件下,SOD吸附量达到5.3366x104U/g；固相SOD的最佳修饰条件:在25℃,pH9.2,50 mmol/L硼砂-硼酸缓冲液中,mPEG与SOD的摩尔比为50:1；修饰后SOD的最佳洗脱条件:0-0.4 M NaCl梯度洗脱,流速为0.96mL/cm2·min。最终获得PEG-SOD的比活力:9638U/mg,纯化倍数1.87倍,氨基修饰率:35.3％。
然后,以自制Cu2+-葡聚糖凝胶G-75为层析介质,研究SOD金属螯合吸附分离-PEG修饰耦合过程。研究结果表明,SOD最佳吸附条件:在pH8.0,温度25℃,溶液浓度1.5 mg/ml,Nacl浓度0.5 M的吸附条件下,SOD吸附量达到9.69x104 U/g；固相SOD的最佳修饰条件:在25℃,pH/9.2,100 mmol/L硼砂-硼酸缓冲液中,mPEG与SOD摩尔比为50:1；修饰后SOD的最佳洗脱条件:pH7.8,25 mmol/L磷酸缓冲液(0.5 mol/L Nacl)洗脱杂蛋白后,再用pH6.0,25 mmol/L磷酸盐缓冲液(0.5 mol/L Nacl,0.5 mol/L的NH4Cl)洗脱SOD。最终获得PEG-SOD的比活:9067.8 U/mg,纯化倍数:1.755倍；氨基修饰率:40.9％,相比等量游离SOD的层析产品,活性保留:88.43％。
最后,考察了修饰后SOD的部分性质,结果发现经修饰后的SOD稳定性获得了提高；同时通过对SOD新的修饰过程探讨,进一步论证了蛋白质吸附分离-化学修饰过程耦合的可行性。