胃癌(gastric cancer,GC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内的发病率仅次于肺癌,位居消化道恶性肿瘤发病率和死亡率的第三位。手术切除仍是目前根治早期胃癌的主要手段。但是术后出现的转移严重影响患者的预后和远期生存。肿瘤微环境中的肿瘤细胞以及肿瘤相关间质细胞能够分泌多种细胞因子,对于肿瘤细胞的存活、干性获得、侵袭和转移、化疗药物抵抗以及生存信号的维持起着至关重要的作用。趋化因子作为肿瘤微环境的重要细胞因子之一,在胃癌细胞的生长以及转移过程中发挥重要作用。白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8或CXCL8)是被研究者最早发现的趋化因子之一,其生物学功能主要是能够诱导中性粒细胞向炎症部位趋化。CXCL8的两个特异性细胞表面受体CXCR1和CXCR2是CXCR家族中的两个重要成员,主要表达于中性粒细胞、CD8+T细胞、CD56+NK细胞、神经血管内皮细胞、肠道表皮细胞等。当CXCL8与CXCR1/2结合的时候,CXCR1/2通过与之偶联的G蛋白,激活下游级联信号传导通路,参与局部和全身炎症反应。最新的研究显示CXCL8及其受体CXCR1/2在多种肿瘤的发生发展、新生血管、肿瘤细胞浸润过程中起重要作用。本研究旨在通过细胞学实验和临床样本检测明确CXCL8/CXCR1信号轴通过诱导胃癌细胞发生EMT样改变促进胃癌细胞恶性进展的相关性,另外通过RNA干扰技术,在胃癌细胞中转染特异性靶向CXCR1基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,sh RNA),下调表达CXCR1基因表达后观察胃癌细胞的增殖及侵袭等生物学行为的变化,并检测可能涉及的信号转导通路中相关蛋白的活性,进而了解CXCR1影响肿瘤发生和发展的分子生物学机制。最后,结合胃癌患者临床病理学资料及生存期分析,评价CXCL8/CXCR1信号轴对于胃癌患者预后判断的价值,为胃癌治疗提供新的策略和理论依据。第一部分CXCL8/CXCR1信号轴在胃癌细胞的表达以及对细胞生长的影响[目的]检测正常人胃上皮细胞和胃癌细胞中CXCR1的表达情况以及CXCR1-sh RNA干扰效果的鉴定,胃癌细胞体外培养时添加CXCL8观察其对细胞生长的影响。[方法]通过蛋白免疫印迹实验检测正常人胃上皮细胞GES1以及3种胃癌细胞系(MKN45、SGC7901和MKN28)中CXCR1的表达情况;同时检测3条CXCR1-sh RNA的干扰效率。镜下观察CXCL8诱导后细胞生长形态的变化;MTT法检测CXCL8对胃癌细胞增殖的影响。[结果]3种胃癌细胞中CXCR1表达水平相比较正常人胃上皮细胞显著增加;MKN45细胞中CXCR1表达较其他胃癌细胞最高,干扰质粒中sh RNA1干扰CXCR1表达效果最佳,可用于后续实验。CXCL8能够诱导胃癌细胞发生EMT样改变,并且促进胃癌细胞在体外增殖。[结论]胃癌细胞中CXCR1表达显著升高;筛选出一条CXCR1-sh RNA可用于后续胃癌细胞生物学行为的研究;CXCL8能够诱导胃癌细胞发生EMT样改变并促进细胞增殖。第二部分CXCL8/CXCR1信号轴诱导EMT促进胃癌细胞侵袭转移的分子机制研究[目的]探讨CXCL8/CXCR1信号轴对胃癌细胞生物学行为的影响以及可能的分子机制。[方法]外源性CXCL8和/或CXCR1-sh RNA处理胃癌细胞后通过MTT、克隆形成实验、transwell实验、细胞划痕实验分别检测胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的变化;光镜下观察细胞形态变化;蛋白印迹检测EMT相关蛋白以及可能涉及的信号通路蛋白的表达差异。[结果]MTT及克隆形成实验结果显示,CXCL8能够促进胃癌细胞MKN45增殖及细胞克隆形成能力,下调表达CXCR1能够显著抑制胃癌细胞增殖及克隆形成能力;Transwell实验和划痕损伤实验的结果显示,CXCL8能够增强胃癌细胞的迁移及侵袭能力,下调表达CXCR1能够显著抑制细胞的移动及侵袭能力。光镜下观察,CXCL8能够诱导胃癌细胞发生EMT样改变,CXCR1-sh RNA则能在一定程度上抑制这种诱导过程。蛋白免疫印迹实验结果显示:CXCL8处理胃癌细胞后上皮标志物E-cadherin表达下调,间质标志物Vimentin表达上调。PI3K、AKT及PTEN的磷酸化与CXCL8/CXCR1密切相关,外源性加入CXCL8可以激活PTEN/PI3K/AKT信号通路,而转染CXCR1-sh RNA后,PTEN/PI3K/AKT通路中各主要成员蛋白的磷酸化水平被明显抑制。[结论]CXCL8/CXCR1信号轴可以通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导胃癌细胞发生EMT改变,通过影响肿瘤细胞恶性生物转化的方式,促进胃癌细胞存活以及发生侵袭转移。第三部分CXCL8/CXCR1信号轴在胃癌组织中的临床意义研究[目的]探讨反映胃癌发生、发展和转移的敏感指标,为胃癌的早期诊断及治疗、病程监控提供一定的客观依据。[方法]通过免疫组化检测CXCR1在胃癌及其癌旁组织标本中的表达情况;收集胃癌患者临床资料,将胃癌患者临床病理学资料结合CXCR1的表达情况进行相关性分析;对108例胃癌患者5年生存率进行Logistic回归分析。[结果]与对应的癌旁组织相比,CXCR1在胃癌组织中表达阳性率明显较高;进一步研究发现,CXCR1表达水平与胃癌患者的年龄,性别,肿瘤大小,血清CEA含量,血清CA19-9含量和是否有肝脏转移等指标无相关性(P>0.05),与肿瘤分化程度(P=0.017)、TNM分期(P=0.006)和是否有淋巴结转移(P=0.035)呈显著相关;CXCR1阳性患者相比较阴性患者其总生存率较低(P=0.043),无复发生存率也更短(P=0.029)。[结论]CXCR1在胃癌组织中表达上调,并且与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移呈显著相关,CXCR1阳性与患者不良预后显著相关,有可能成为临床上预后判断的指标之一。