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目的:我国皮肤科唯一国医大师,广州中医药大学第二临床医学院禤国维教授以养血润燥化瘀、凉血解毒止痒为法,创制银屑灵片。经卢传坚教授带领的研究团队经过十余年的研究,对该处方进行精简优化得到银屑灵优化方。银屑灵优化方由莪术、赤芍、肿节风、土茯苓等中药组成。课题组的临床研究表明银屑灵优化方治疗寻常型银屑病安全有效,基础研究提示银屑灵优化方能够明显改善小鼠类银屑病模型的皮损症状以及抑制人角质形成细胞HaCaT增殖,具有抗炎和调节免疫的作用,但银屑灵优化方对银屑病病理关键环节表皮自噬和血管新生的作用亟需阐明。本研究采用咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)诱导的小鼠类银屑病模型,以及体外培养的人永生化角质形成HaCaT细胞模型和IL-17A诱导HUVEC细胞模型,观察银屑灵优化方对表皮自噬和血管新生的影响,并探讨银屑灵优化方对表皮自噬和血管新生的调控机制,进一步明确银屑灵优化方治疗银屑病的作用机制和科学内涵。方法:1.建立小鼠类银屑病模型和观察药物治疗效果:将Balb/c小鼠随机分为正常对照组、IMQ造模组、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组、银屑灵优化方低剂量组和高剂量组。IMQ软膏涂抹小鼠背部皮肤7天进行类银屑病造模,造模过程中隔日测量和评估小鼠红斑、鳞屑、浸润程度、银屑病面积和严重度指数(Psoriasis areas and severity index,PASI)评分,第七天拍照取材,HE染色。2.Western blot检测银屑灵优化方对银屑病小鼠皮损组织中自噬相关蛋白和PI3K/Akt/mTOR通路表达的影响,免疫组化检测银屑病小鼠皮损中p-mTOR的表达和分布情况。3.采用TNF-α诱导人角质HaCaT细胞制备银屑病细胞模型,细胞分组包括:空白对照组、TNF-α模型组、银屑灵优化方低剂量组和高剂量组、阳性药物组。MTT法检测各组细胞增殖情况,AV-PI流式法检测各组细胞凋亡水平,分光光度法检测细胞中Caspase 3活性。4.RT-PCR检测HaCaT细胞中自噬相关蛋白mRNA的表达;Western Blot检测HaCaT细胞中自噬相关蛋白的表达;透射电镜检测HaCaT细胞中自噬泡的数量;使用Western blot检测细胞中Atg16L1的表达和MTT检测细胞增殖,分析自噬诱导剂Rapamycin和自噬抑制剂3-MA对TNF-a刺激HaCaT细胞自噬和增殖的影响。5.Western Blot检测HaCaT细胞中PI3K/Akt/mTOR通路的磷酸化水平;使用Western blot检测细胞中Atg16L1的表达和MTT检测细胞增殖,分析PI3K抑制剂LY294002对TNF-α刺激HaCaT细胞自噬和增殖的影响。6.建立小鼠类银屑病模型:将Balb/c小鼠随机分为正常对照组、IMQ造模组、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组、银屑灵优化方低剂量组和高剂量组。IMQ软膏涂抹小鼠背部皮肤7天进行类银屑病造模,实验第7天剪开各组小鼠背部皮损部位翻转进行照相,分光光度法检测皮损组织中氧化应激分子的水平,荧光定量PCR检测皮损组织中炎性细胞因子、VEGF和HIF-1 α mRNA表达,免疫组化检测IMQ小鼠皮损组织中VEGFR1、Angiopoietin 1 和 HIF-1 α 表达,Western Blot 检测小鼠皮损中 MAPK 信号通路的磷酸化水平。7.采用IL-17A诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC制备体外血管新生模型,MTT法检测各组HUVEC细胞增殖,transwell迁移实验检测HUVEC细胞迁移,分光光度法检测HUVEC细胞中氧化应激分子的水平,荧光定量PCR检测HUVEC细胞中炎性细胞因子mRNA表达,ELISA检测细胞中HIF-1 α和VEGF的水平,Western Blot检测HUVEC细胞中血管新生分子和MAPK通路的表达水平。结果:1.银屑灵优化方对IMQ诱导的小鼠类银屑病模型的改善作用及调控自噬机制A.银屑灵优化方对小鼠类银屑病模型的改善作用对小鼠类银屑病皮损改善的影响:IMQ软膏可诱导小鼠背部皮肤银屑病样皮损,与人类银屑病皮损相似,PASI评分增高,MTX及银屑灵优化方低剂量和高剂量可改善小鼠银屑病样皮损并降低PASI评分。对皮肤病理组织学的影响:HE染色结果表明,IMQ造模组小鼠皮损出现银屑病样的组织学形态,MTX组及银屑灵优化方低剂量组和高剂量组的银屑病样组织学形态改善。B.银屑灵优化方对小鼠类银屑病模型皮损中自噬蛋白和PI3K/Akt/mTOR通路的影响Western Blot结果表明IMQ组皮损中自噬相关蛋白的表达比正常组显著降低;银屑灵优化方低剂量组和高剂量组皮损中自噬相关蛋白的表达显著升高;IMQ造模组小鼠皮损中PI3K 85 α、Akt、mTOR分子的磷酸化水平明显升高,低剂量和高剂量银屑灵优化方可以显著抑制PI3K 85 α、Akt、mTOR分子的磷酸化;p-mTOR免疫组化染色结果表明,IMQ造模组皮损组织中表皮及真皮层褐色沉淀颗粒面积相对于正常对照组显著增多,银屑灵优化方低剂量组和高剂量组及MTX组真表皮中褐色沉淀颗粒面积比IMQ造模组显著减少。2.银屑灵优化方对TNF-α刺激HaCaT细胞自噬作用机制A.银屑灵优化方对TNF-α激HaCaT细胞增殖和凋亡的影响MTT法检测细胞增殖结果表明,与空白组细胞比,TNF-α组细胞增殖率明显升高;与TNF-α组比,0.625 mg/ml-10 mg/ml的银屑灵优化方明显抑制HaCaT细胞增殖。根据结果,我们选用2.5 mg/ml和5 mg/ml作为后续细胞实验银屑灵优化方的给药浓度。流式检测结果表明,与空白组细胞比,TNF-α组细胞凋亡率明显降低;与TNF-α组比,2.5 mg/ml和5 mg/ml银屑灵优化方组和MTX组细胞凋亡率显著升高。与空白组细胞比,TNF-α组HaCaT细胞Caspase 3活性无明显变化:与TNF-α组比,低剂量和高剂量银屑灵优化方组和MTX组HaCaT细胞Caspase 3活性显著升高。此外,自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂Z-VAD可以在给予银屑灵优化方的基础上不同程度促进细胞增殖。B.银屑灵优化方对TNF-α刺激HaCaT细胞自噬的影响RT-PCR实验结果表明,与空白组比,TNF-α组自噬相关蛋白Beclin 1、Atg 5、Atg 12、Atg 7、Atg 16L1、Atg 3 mRNA水平显著降低;与TNF-α组比,低剂量和高剂量银屑灵优化方组和MTX组HaCaT细胞中Beclin 1、Atg 5、Atg 12、Atg 7、Atg 16L1 mRNA水平明显升高。Western blot实验结果表明,与空白组比,TNF-α组自噬相关蛋白 Beclin 1、Atg 5、Atg 12、Atg 7、Atg 16L1、Atg 3 蛋白表达水平显著降低;与TNF-α组比,低剂量和高剂量银屑灵优化方组HaCaT细胞中Beclin 1、Atg 5、Atg 3、Atg 12、Atg 16LI蛋白水平明显升高。透射电镜实验结果表明,与空白组比,TNF-α组自噬泡数量减少,内容物减少;与TNF-α组比,低剂量和高剂量银屑灵优化方组HaCaT细胞中自噬泡数量增加。给予HaCaT细胞自噬诱导剂Rapamycin,观察银屑灵优化方和自噬诱导剂合用对细胞自噬和增殖的影响。实验结果表明,与TNF-α组比,银屑灵优化方与自噬诱导剂合用组、自噬诱导剂组、银屑灵优化方组,三组均可显著上调自噬蛋白Atg 16L1的表达,三组间无统计学差异;与TNF-α组比,银屑灵优化方与自噬诱导剂合用组、自噬诱导剂组、银屑灵优化方组,三组均可显著抑制TNF-α刺激HaCaT细胞增殖,三组间无统计学差异。给予HaCaT细胞自噬抑制剂3-MA,观察银屑灵优化方和自噬抑制剂合用对细胞自噬和增殖的影响。实验结果表明,与TNF-α组比,银屑灵优化方组可显著上调自噬蛋白Atg 16L1的表达;与TNF-α 比,自噬抑制剂组、银屑灵优化方与自噬抑制剂合用组可显著抑制自噬蛋白Atg 16L1的表达;与TNF-α组比,自噬诱导剂组可显著促进TNF-a刺激HaCaT细胞增殖。C.银屑灵优化方对PI3K/Akt/mTOR信号通路调控TNF-α刺激HaCaT细胞自噬的影响Western Blot检测实验结果表明,与空白组比,TNF-α组p-PI3K 85 α/PI3K 85α、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的比例显著增加;与TNF-α组比,低剂量和高剂量银屑灵优化方组 HaCaT 细胞中 p-PI3K 85 α/PI3K 85 α、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 的比例显著下降。给予HaCaT细胞PI3K抑制剂LY294002,观察银屑灵优化方和PI3K抑制剂合用对细胞自噬和增殖的影响。实验结果表明,与TNF-α组比,银屑灵优化方与PI3K抑制剂合用组、PI3K抑制剂组、银屑灵优化方组,三组均可显著上调自噬蛋白Atg 16L1的表达;与TNF-α组比,银屑灵优化方与PI3K抑制剂合用组、PI3K抑制剂组、银屑灵优化方组,三组均可显著抑制TNF-α刺激HaCaT细胞增殖,三组间无统计学差异。D.银屑灵优化方对IMQ模型小鼠皮损血管新生的作用及机制实验第7天剪开各组小鼠背部皮损部位翻转进行照相,实验结果表明,同正常对照组比,IMQ造模组皮损组织中血管新生数量增加明显,血管迂曲增多;与IMQ造模组比,MTX组、银屑灵优化方低剂量组和高剂量组小鼠皮损新生血管数量减少,血管迂曲改善。分光光度法检测皮损组织中氧化应激分子的水平实验结果表明,同正常对照组小鼠相比,IMQ造模组皮损组织中SOD的水平显著降低,LDH、MDA和CAT水平显著升高;与IMQ造模组比,银屑灵优化方高剂量组皮损组织中SOD的水平显著升高,LDH、MDA和CAT水平显著降低。RT-PCR实验结果表明,同正常对照组小鼠相比,IMQ造模组皮损组织中IL-6、TNF-α、IL-17A和IL-17F mRNA表达显著升高;与IMQ造模组比,银屑灵优化方高剂量组皮损组织中IL-6、TNF-α、IL-17A和IL-17F mRNA表达水平降低明显。荧光定量RT-PCR检测结果表明,与正常对照组小鼠比,IMQ造模组皮损组织中VEGF和HIF-1 α mRNA表达显著升高;与IMQ造模组比,银屑灵优化方低剂量组皮损组织中VEGF和HIF-1 α mRNA表达水平明显降低。免疫组化检测结果表明,VEGFR1、Angiopoietin 1、HIF-1 α免疫组化染色结果表明,IMQ造模组皮损组织表皮及真皮层褐色沉淀颗粒颜色和面积相对于正常对照组显著增多,银屑灵优化方低剂量组和高剂量组及MTX组皮损组织真表皮中褐色沉淀颗粒颜色和面积比IMQ造模组显著减少。Western Blot检测结果表明,同正常对照组小鼠相比,IMQ造模组皮损组织中VEGFR1、Angiopoietin 1和HIF-1 α蛋白表达水平显著升高;与IMQ造模组比,银屑灵优化方高剂量组和MTX组皮损组织中VEGFR1、Angiopoietin 1和HIF-1 α蛋白表达水平显著降低;同正常对照组小鼠相比,IMQ造模组皮损组织中p-ERK/ERK、p-P38/P38、p-JNK/JNK的比值显著升高;与IMQ造模组比,银屑灵优化方低剂量组和MTX组皮损组织中p-ERK/ERK、p-P38/P38、p-JNK/JNK的比值显著降低。E.银屑灵优化方对IL-17A刺激HUVEC细胞增殖和迁移的影响MTT法检测细胞增殖结果表明,与空白组细胞比,IL-17A组细胞增殖率明显升高;与IL-17A组比,1.25 mg/ml-15 mg/ml浓度的银屑灵优化方明显抑制HUVEC细胞增殖。根据结果,我们选用1.25 mg/ml和2.5 mg/ml作为后续细胞实验银屑灵优化方的给药浓度。细胞迁移实验结果表明,与空白组细胞比,IL-17A组细胞迁移数量明显增多;与IL-17A组比,1.25 mg/ml和2.5mg/ml浓度的银屑灵优化方组HUVEC细胞迁移数量明显减少。分光光度法检测细胞中氧化应激分子的水平实验结果表明,与空白组比,IL-17A组HUVEC细胞中SOD的水平显著降低,LDH、ROS、MDA、GSH和CAT水平显著升高;与IL-17A组比,银屑灵优化方高剂量组细胞中SOD的水平显著升高,ROS、GSH、MDA和CAT水平显著降低。RT-PCR检测结果表明,与空白组比,IL-17A组HUVEC细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6水平显著升高;与IL-17A组比,银屑灵优化方低剂量组细胞中IL-6的水平显著降低,银屑灵优化方高剂量组细胞中TNF-α水平显著降低。ELISA检测结果表明,与空白组比,IL-17A组HUVEC细胞中HIF-1 α和VEGF 水平显著升高;与IL-17A组比,银屑灵优化方高剂量组细胞中HIF-1 α的水平显著降低,银屑灵优化方低剂量组细胞中VEGF水平显著降低。Western Blot检测结果表明,与空白组比,IL-17A 组HUVEC 细胞中 VEGFR1、VEGFR2、Angiopoietin 1 和 HIF-1α 蛋白表达水平显著升高;与IL-17A组比,银屑灵优化方低剂量组细胞中VEGFR1、VEGFR2、Angiopoietin 1和HIF-1 α蛋白表达水平显著降低。与空白组比,IL-17A组HUVEC细胞中p-ERK/ERK、p-P38/P38、p-JNK/JNK的比例显著升高;与IL-17A组比,银屑灵优化方低剂量组和MTX组细胞中p-ERK/ERK、p-P38/P38、p-JNK/JNK的比例显著降低。结论:1.在IMQ诱导的小鼠类银屑病模型中,银屑灵优化方可通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化,上调类银屑病模型小鼠皮损组织中的自噬相关蛋白表达水平,从而改善IMQ诱导的小鼠类银屑病样皮损。2.在TNF-α刺激HaCaT细胞体外模型中,银屑灵优化方通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化,上调HaCaT细胞自噬水平,进而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。3.在IL-17A诱导HUVEC细胞模型中,银屑灵优化方可以通过抑制MAPK信号通路磷酸化,抑制IL-17A刺激HUVEC细胞中血管新生相关分子:VEGFR1、VEGFR2、Angiopoietin 1和HIF-1 α合成,抑制氧化应激分子和炎症细胞因子的表达,进而抑制细胞迁移和增殖。4.在IMQ诱导的小鼠类银屑病模型中,银屑灵优化方可以通过抑制MAPK信号通路活化,抑制氧化应激分子和炎症细胞因子表达,抑制小鼠皮损组织中血管新生相关分子合成,进而抑制皮损部位血管新生。