论文部分内容阅读
小麦白粉病和条锈病是由Blumeriagraminis（DC.）E.O.Speer f.sp.tritici和 Puccinia striiformis West.f.sp.tritici Eriks et Henn引起的世界性小麦主要病害,在我国各小麦主产区常年发生。培育和推广抗病品种是减少病害损失最经济、有效和环保的方法。将小麦近缘植物优异基因向普通小麦导入,是丰富普通小麦日益狭窄遗传基础的重要手段之一。发掘和利用小麦近缘植物中的抗病基因,筛选与抗病基因紧密连锁的分子标记,剖析抗病种质的抗性分子机理,对于丰富小麦的抗病基因资源,转移和累加抗病基因,阐明抗性的分子机制具有重要的理论意义和实践价值。本研究以138份人工合成小麦,92份普通小麦及其近缘植物和1份卵穗山羊草为研究对象,分析种质资源的遗传多样性;筛选白粉病和条锈病的抗源材料,开展抗病基因标记定位,同时利用自交、回交方法进行抗条锈病或抗白粉病新种质的选育;结合细胞学鉴定,通过山羊草属和普通小麦远缘杂交转移抗白粉病基因;构建白粉病胁迫下的抗白粉病卵穗山羊草苗期叶片的cDNA文库,比对、分析和筛选抗性相关基因。主要研究结果如下:1.人工合成小麦、普通小麦及其近缘植物的遗传多样性分析138份人工合成小麦HMW-GS遗传多样性分析表明,在Glu-A1位点上存在5种变异类型和1种新亚基;在Glu-B1位点上存在13种等位变异类型和5种新亚基,其中14+15、6+8、7+8分别占总数的21.7%、33.3%和29.7%;在Glu-D1位点上存在13种等位变异类型和4种新亚基,其中 1.5+10、2+12、2+12.5、5+10分别占总数的21.7%、22.5%、16.7%、13.0%。92份小麦及其近缘植物的SSR标记遗传多样性研究表明,44对SSR引物在92份小麦不同种属中共扩增出274个多态性等位位点,平均每个SSR位点检测到6.32个等位位点,其中D染色体组检测的平均等位基因数最高（6.90）,A染色体组（6.13）次之,B染色体组（5.94）最低。多态性信息量PIC范围在0.3589～0.8854之间,平均是0.7482。44对SSR引物在小麦近缘种属7个部分同源群的遗传多样性比较,遗传多样性最高的是第5同源群（0.1585）,最低的是第7同源群（0.0882）。聚类分析和主成分分析表明,所有物种的分类基本和生物学分类一致,A基因组和D基因组明显的分成2类。具有AABB基因组的种质存在更丰富的遗传多样性,其中硬粒小麦和圆锥小麦聚在一类,是因为它们在形态上具有相似性,可能具有更近的亲缘关系。同时表明四倍体小麦与六倍体的亲缘关系很近,与普通小麦育成品种相比,斯卑尔脱小麦、云南小麦和西藏半野生小麦有更丰富的遗传多样性。聚类分析和主成分分析的分类结果基本一致,但主成分分析更能直观的显示物种之间的亲缘关系。2.人工合成小麦抗白粉病和条锈病基因的挖掘、定位及其利用根据138份人工合成小麦的抗病性鉴定结果,筛选出抗白粉病种质27份,占总数的19.5%,其中免疫、高抗和中抗种质分别为21份、2份和4份;筛选出抗条锈病种质55份,占总数的39.9%,其中免疫、高抗和中抗材料分别为28份、12份和15份;筛选出兼抗白粉病和条锈病的人工合成小麦10份;筛选出抗白粉病种质SE5785和抗条锈病的种质SE5756。抗白粉病人工合成小麦SE5785和感病品种小偃22杂交组合的F1和F2代126个单株的遗传分析表明,SE5785对白粉菌生理小种E09的抗性由一对隐性基因控制,暂命名为PmSE5 785。利用集群分离分析法（BSA）筛选到与PmSE5 785连锁的SSR标记Xbarc59、Xgwm539、Xcfd62和Xwmc817,4个标记都位于PmSE5785一侧,最近的标记Xbarc59遗传距离为7.3cM,遗传连锁图全长18.9 cM,并将该基因定位在2D染色体上,与已有的定位于2D染色体上的抗白粉病基因分析表明,PmSE5785可能是1个新的抗白粉病基因。抗条锈病人工合成小麦SE5756和感病品种西农979杂交组合的F1和F2代116个单株的遗传分析表明,SE5756对条锈菌生理小种CYR32的抗性由一对显性基因控制,暂命名YrSE5756。利用BSA法筛选到与YrSE5756连锁的10个SSR标记,分别是Xwmc626、Xwmc269、Xgwm11、Xbarc137、Xwmc419、Xwmc85、Xgpw5237、Xwmc1 34、WE1 73（Yr26距离最近的EST）和Xwmc631,其中Xwmc419和Xwmc85位于YrSE5756两侧,遗传距离分别为2.3和1.8 cM,遗传连锁图全长70.1 cM,并将该抗病基因定位在1B染色体上。在遗传分析的同时,通过合成小麦SE5785、SE5756与感病的普通小麦优良栽培品种的杂交、回交和加代,获得抗白粉病、大粒、形似普通小麦的新种质N07228-1和N07228-2以及抗条锈病、大粒、形似普通小麦的种质N07178-1、N07178-2、N08256-1和N08256-2。3.粗山羊草和卵穗山羊草抗白粉病基因向普通小麦的转移抗白粉病人工合成小麦NA0928-1-1-1的创制:23份四倍体小麦与8份抗白粉病粗山羊草的57个杂交组合F1代结实率的统计分析发现,四倍体小麦为母本的结实率平均在0.74%～7.70%,其中四倍体小麦MY3478为母本时的结实率最高,平均达到7.70%;粗山羊草为父本的结实率平均在1.70%～5.25%,粗山羊草SY41为父本时的结实率最高,平均为5.25%,说明四倍体小麦MY3478和粗山羊草SY41中可能含有可结实性基因强于其他四倍体和粗山羊草的可结实性基因。结实率最高（17.19%）的组合NA0928（MY3478/SY41）后代的形态学和细胞学鉴定表明,其形态上与普通小麦相似,壳与粗山羊草相似,壳硬、难脱粒,F2代染色体数目主要为41条和42条,F3代获得1份形态学和细胞学（2n=42,AABBDD）基本稳定的抗白粉病人工合成小麦NA0928-1-1-1。卵穗山羊草SY156中抗白粉病基因向普通小麦转移:通过对中国春-卵穗山羊草（SY156）杂交F1代形态学、高分子量麦谷蛋白亚基、细胞学和分子标记鉴定表明,F1代为真杂种。F1代进行自交和回交,以后世代自交。不同世代的细胞学和抗病性鉴定发现,在自交后代,随着世代的增加,结实率明显增加;与自交后代相比,回交后代的结实率明显高于自交后代的结实率。在不同世代,株高、穗长、每穗小穗数、穗粒数、分蘖数、结实率及籽粒性状的变异类型非常丰富,与回交后代相比,自交后代的变异更大,类型更多。随着自交和回交世代的增进,染色体数目逐渐减少,但回交世代染色体数目减少的更快。衍生后代的白粉病抗性鉴定发现,自交后代的抗病性单株明显多于回交后代的抗病植株。亲本和衍生后代的SSR标记筛选发现,23个标记在衍生后代混合样中表现卵穗山羊草的特异性条带,并对6个株系衍生后代进行了特异性标记的检测。通过对衍生后代白粉病抗性鉴定,获得了一些抗白粉病的中国春-卵穗山羊草衍生后代。4.白粉病菌诱导的卵穗山羊草苗期叶片cDNA文库的构建和分析为了获得卵穗山羊草（SY156）与白粉病抗性相关的基因,构建了白粉菌生理小种E09诱导后的卵穗山羊草12h、24h、36h、48 h和96h的苗期叶片混合cDNA文库。从文库中随机挑取阳性克隆经PCR检测,利用DNAStar软件对所获EST序列进行聚类拼接,得到409个EST序列。在聚类结果中,EST序列的片段大小在205-1574bp之间,平均为536 bp。409条EST序列中,44（10.76%）条没有找到同源性的蛋白序列,365（89.44%）条找到同源性较高的蛋白序列,其中307条已知蛋白功能。对已知功能的序列运用Pathway软件进行功能分类,主要涉及细胞进程34条（8.31%）、环境信息55条（13.45%）、抗病防御46条（11.25%）、遗传信息33条（8.07%）、新陈代谢127条（31.05%）、生物有机体12条（2.93%）和假定蛋白58条（14.18%）,这些EST序列为卵穗山羊草白粉病抗性相关基因的获得和抗病机制的研究奠定了基础。