随着人们对肉的需求量越来越大,肉制品安全问题引起了广泛关注,一些不法商家甚至使用猫、狗、狐、水貂等常见食肉目动物的肉进行掺假售卖。据报道,猫、狗、水貂等食肉目动物具有感染和传播新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-Co V-2）的风险,且是多种人畜共患病的宿主,食用这些肉容易造成疫病传播,给人们的健康带来隐患。目前已建立了多种基于物种特异性DNA序列的动物种源成分检测方法。这些方法多以线粒体DNA为靶标,容易因不同品种或个体的引物结合区域变异而造成假阴性的检测结果。而且,在对多个物种检测时需要同时使用多对引物,常因引物之间的相互作用而影响检测的效率和准确性,更难以做到同时对多种食肉目动物的现场快速检测。因而,本研究拟在核基因组上筛选猫、狗、狐、水貂特异性靶标序列,并将通用引物与RPA、实时荧光PCR相结合来建立常见的非食用食肉目动物种源成分的现场快速筛查方法以及实验室精准检测方法。主要结果如下:（1）猫、狗、狐、水貂4物种种源成分检测的靶标序列筛选:通过多物种核基因组比对分析,筛选得到一段来自狗的核基因组上的DNA序列（NC＿051821.1）,用作鉴定和区分猫、狗、狐、水貂的靶标序列。猫、狗、狐、水貂靶标序列的同源率都不低于80%,序列长度分别为339 bp、335 bp、335 bp和332 bp,而在其它40个非目标物种中不存在同源序列或存在同源率非常低且片段长度低于200 bp的同源序列。进一步的Clustal W多序列比对发现,猫、狗、狐、水貂靶标序列与其它物种的同源序列相比,整体上具有较高的序列差异性。仅对于猫、狗、狐、水貂靶标序列而言,四者序列两端的保守性良好,而在序列内部存在明显的碱基差异。这些特点说明猫、狗、狐、水貂靶标序列对于目标物种（猫、狗、狐、水貂）相对保守,对非目标物种来说具有良好的特异性,可用来很好的鉴定和区分猫、狗、狐、水貂。（2）猫、狗、狐、水貂4物种种源成分现场快速筛查方法的建立:在猫、狗、狐、水貂靶标序列的保守区设计了RPA的通用引物,并对RPA的反应体系和条件进行了优化。该反应可在恒温（42℃）条件下进行,仅需要30 min即可完成。通过琼脂糖凝胶电泳对RPA产物进行分析,发现仅在猫、狗、狐、水貂阳性样品中有目的条带的扩增,而在牛、羊、驴、猪、鸡等常见食用动物中均没有扩增,表明建立的RPA快速方法可用于对肉制品中猫、狗、狐、水貂种源成分进行初步筛查。只要样品中含有猫、狗、狐、水貂成分,即可被检测出来,但不能对这4个目标物种进行区分。（3）猫、狗、狐、水貂4物种种源成分实验室精准检测方法的建立:在猫、狗、狐、水貂靶标序列的保守区和变异区分别设计实时荧光PCR的通用引物和物种特异性Taq Man探针。使用单重实时荧光PCR在21个常见动物物种中对引物和探针的特异性进行了检测,结果表明引物和探针具有良好的特异性。通过对多重实时荧光PCR的反应条件和体系进行优化,确定了猫、狗、狐、水貂特异性Taq Man探针的最优比例为6:3:8:2,并建立了用于对肉制品中猫、狗、狐、水貂种源成分精准鉴定和区分的通用引物——多重实时荧光PCR（universal primer multiplex real-time PCR,UP-M-rt PCR）方法。该方法的绝对检出限为0.05 ng/μL,相对检出限为0.05%（w/w）。使用该方法对6个自制的不同掺假比例的多物种混合肉样进行检测,检测结果与实际的掺假成分完全一致,证明该方法具有极好的准确性。综上,本研究在核基因组上筛选到了可用于特异性检测猫、狗、狐、水貂的靶标序列,并建立了猫、狗、狐、水貂4物种种源成分的RPA现场快速筛查方法以及UP-M-rt PCR实验室精准检测方法,可为监管部门提供有效的技术支撑。