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防御素是动物天然免疫中的重要组成部分,为一种抗菌肽。具有抗真菌、细菌以及抗病毒等作用。还具有杀死肿瘤细胞等生物学功能。相关研究已经比较深入。但防御素一直没有被广泛使用,原因在于大规模生产上存在困难。本实验通过两种方法体外表达绵羊防御素,并经过纯化,对其抗菌作用进行研究,为防御素应用研究和产业化提供实验依据,结果如下:方法一:与SUMO共同融合表达方法通过PCR扩增蒙古绵羊β防御素-1(SBD-1)基因,与SUMO基因连接后,构建获得pET-22b-SUMO-SBD-1重组质粒,将重组质粒转入BL21(DE3)细胞表达。分别通过超声破碎,脱盐,亲和层析,浓缩,SUMO酶切,冷冻干燥等技术处理后,获得绵羊β-防御素-1(SBD-1)。方法二:与类弹性蛋白ELP(Elastin-Like Protein,ELP)共同融合表达方法用PCR的方法克隆得到编码SBD-1的成熟肽全基因序列,ELP基因连接,克隆入原核表达载体pET-22b中,构建表达载体pET-22b-ELP-SBD-1,通过相关软件优化密码子,获得优化的ELP-SBD-1基因序列。以此序列为基础,合成该基因。将合成的优化的ELP-SBD-1基因转入原核表达载体pET-22b,获得重组pET-22b-ELP-SBD-1质粒。用重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌原核表达,在不同温度下用IPTG诱导ELP-SBD-1融合蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示:在37℃条件下,融合蛋白均可以表达。在18℃条件下,0.1~3 m M IPTG均能诱导融合蛋白表达,其中0.5 mM IPTG诱导表达产物的量较多。在14-20h时间内融合蛋白表达量随诱导时间的延长呈上升趋势,诱导到16h时表达量最高。通过超声破碎手段,ELP可逆相变循环ITC(inversetransition cycling,ITC)对蛋白进行纯化,确定纯化的最适p H值、可逆相变温度等条件。纯化的产物过镍柱(脱盐、亲和层析)后进一步纯化,最终经过浓缩,成功获得绵SBD-1。两种方法获得的SBD-1,验证其分别作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的效果,通过抑菌实验证明,获得的SBD-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都能形成抑菌环,具有抑菌作用。