茉莉A病毒全长cDNA克隆构建及其分子特性分析

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茉莉是我国一种重要的观赏及经济作物,但其生长过程中常受到多种病原物的危害,给茉莉生产带来损失。目前关于茉莉病毒的报道有四种,但相关的研究很少且不够深入,因此关于茉莉病毒病害的研究对于茉莉病毒病害防治及提高茉莉的产量和质量具有重要的意义。
  我们在田间观察到一种典型的病毒病症状:枝上小叶密集,形成的叶片丛簇或扫帚状,花畸形甚至不能开花。经RNA高通量测序分析预测,并通过实验发现一种未报道过的长线性病毒科(Closteroviridae),毛形病毒属(Crinivirus)病毒,并将其命名为茉莉A病毒(Jasmine virus A,JaVA)。该属病毒为单链正义RNA病毒且具有两条基因组RNA1与RNA2,而预测结果表明该茉莉中除正常两条RNA链外还存在一条与RNA1结构相似,但序列相似度仅为67.63%的基因组,且未找到与之对应的RNA2,我们暂且认为茉莉A病毒含有3条基因组并分别命名为JaVA1-RNA1,JaVA1-RNA2与JaVA2-RNA1。该病毒全长序列分别为8237nt、8003nt与8228nt,预测RNA1含有3个开放阅读框(Open reading frame,ORF),RNA2含有7个ORF,符合毛形病毒属病毒结构特征。将获得的JaVA病毒基因组各ORF分别与毛形病毒属所有病毒各ORF进行核苷酸及氨基酸序列相似度比对,结果表明其相似度符合成立该属新成员的标准。本实验还对其热休克蛋白、外壳蛋白及RNA依赖的RNA聚合酶进行进化树分析,发现其与毛形病毒属成员均具有较高的同源性,因此认为JaVA为毛形病毒属的一个新成员。
  为进一步研究JaVA相关的生物学特征、致病机制和传播方式等,我们构建了茉莉A病毒全长cDNA克隆。将病毒的三条基因组分别克隆到pXT载体上,获得pXT-cri1、pXT-cri2与pXT-cri3阳性克隆。通过排列组合的方式利用农杆菌对本氏烟进行复合侵染,7天后,接种叶能检测到病毒基因组序列,但系统叶不能,因此该侵染性克隆还未能在本氏烟中具有侵染性。
  为了进一步探究JaVA与茉莉典型的皱缩丛簇症状之间的关系,我们对不同症状茉莉中的不同病毒的含量进行了对比分析。首先采取无毒茉莉、黄化花叶症状茉莉、重症皱缩茉莉以及轻症皱缩茉莉四种叶片样品,利用荧光定量PCR的方法,对各样品内茉莉A病毒的三条基因组、茉莉C病毒、茉莉H病毒和茉莉T病毒的含量进行检测,结果表明具有皱缩丛簇症状的茉莉叶片中JaVA三条基因组的含量与黄化花叶症状茉莉叶片相比均明显增加,而其他三种病毒并无明显变化,因此说明茉莉皱缩丛簇病毒症状与茉莉A病毒具有一定的相关性。
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