决明(Cassia obtusifolia L)为豆科决明属植物，对干旱与重金属有较强的抗性。实验室前期的研究从决明中克隆了Kunitz型蛋白酶抑制剂(Cassia obtusifolia Kunitz protease inhibitor, COKI)，并获得转COKI基因拟南芥株系，发现其具有较强的抗旱能力。本研究对该转COKI基因拟南芥抗旱生理与分子机制开展初步探究，具体内容如下：以野生型Col-0及转COKI基因拟南芥为研究对象，比较分析两种基因型拟南芥在干旱胁迫下的成苗表型及显微结构差异；COKI基因表达产物的亚细胞定位；对干旱胁迫下的野生型Col-0及转COKI拟南芥根系进行基因差异表达分析，以挖掘可能受COKI调控的干旱应答基因；拟南芥AT1G76780基因的功能研究；将COKI基因转化大肠杆菌，摸索最适原核表达条件，获得可溶性蛋白。以上研究内容为揭示COKI参与植物干旱应答的分子机制研究奠定了基础。主要研究成果如下：
　　1.比较分析干旱胁迫下野生型Col-0及转COKI拟南芥成苗表型及显微结构的差异，发现转COKI拟南芥在土壤干旱胁迫时表现为早花表型。根、茎的石蜡切片观察结果显示干旱胁迫下转COKI拟南芥茎中的维管束数目多于野生型Col-0，根系木质化程度更高，导管数目更多且排列更为紧密。表明干旱胁迫下转COKI拟南芥相较于野生型Col-0在水分及养料运输方面更具优势，从而具有更强的耐旱性。
　　2.以GFP作为报告基因，构建融合表达载体。利用农杆菌介导在洋葱内表细胞进行瞬时表达，荧光检测结果显示COKI主要定位于细胞膜；切除其N端跨膜结构域后，荧光信号在细胞质、细胞核中均有分布，无特异性。表明跨膜结构域会影响COKI的亚细胞定位。此外，采用花序侵染法获得了COKI-GFP的稳定遗传株系。原生质体镜检结果显示荧光信号集中于细胞膜，与洋葱瞬时表达结果一致，表明COKI主要定位于细胞膜。
　　3.对干旱胁迫的野生型Col-0及转COKI拟南芥根系进行基因差异表达分析，以探究转COKI拟南芥抗旱的分子机制。共筛选得到108个差异表达基因，其中相较于野生型Col-0在转COKI拟南芥中有26个基因呈上调表达，82个呈下调表达。GO富集分析结果表明转COKI拟南芥抗旱的分子机制主要涉及代谢、氨基酸转运、蛋白质加工等过程的变化。KEGG富集分析结果表明转COKI拟南芥通过次生代谢产物合成及内质网蛋白加工等过程的协调作用共同抵御干旱胁迫。通过差异表达基因蛋白互作网络分析，推测HSP20及HSP20-like蛋白家族在转COKI拟南芥干旱响应过程可能发挥重要作用，COKI可能通过介导HSP20及HSP20-like基因的上调表达以增强植株对干旱的耐受性。结合差异表达基因的功能注释及PPI分析结果，利用qRT-PCR对10个在转COKI拟南芥中呈上调表达的基因进行表达量验证，结果与转录组表达量趋势一致，表明转录组数据真实可靠。
　　4.基于差异表达基因分析结果，对AT1G76780基因(编码HSP20-like分子伴侣)进行功能研究，在SALK库中订购该基因的缺失突变体，比较分析野生型Col-0与hsp20-like突变体在干旱胁迫下的表型差异，探究该基因在拟南芥干旱响应过程中的作用。萌发率统计结果显示野生型Col-0与hsp20-like突变体在无胁迫、2%PEG及3%PEG处理三种培养条件下的种子萌发率均无显著性差异，表明AT1G76780基因的缺失对拟南芥种子萌发过程无影响。幼苗平板胁迫实验显示2%PEG处理时两基因型拟南芥幼苗长势相近，无明显差异；3%PEG处理时，野生型Col-0拟南芥相较于hsp20-like突变体具有更长的主根，表明随着干旱胁迫程度的加深野生型拟南芥相较于hsp20-like突变体具有更强的水分输导能力。成苗自然干旱胁迫实验结果显示hsp20-like突变体对干旱更为敏感。离体叶片失水实验结果显示野生型拟南芥相较于hsp20-like突变体具有更慢的离体叶片失水速率。以上结果表明AT1G76780基因的缺失会导致干旱敏感表型的产生。
　　5.比较分析3种原核表达载体的表达效果，最终确定pGEX-4T-1-COKI-ΔTM重组载体在IPTG终浓度为0.5mM，11℃过夜诱导条件下可实现重组COKI蛋白的部分可溶性表达。利用GST亲和柱对重组蛋白进行纯化，并进行Western-Blot验证，在目标位置显示单一条带，表明经诱导表达、纯化所得蛋白为COKI。为后续COKI蛋白体外功能研究奠定基础。