家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）是影响夏秋季蚕茧生产的主要病原微生物之一，对家蚕具有高致病性。该病毒主要感染家蚕中肠柱状上皮细胞，致使家蚕罹患浓核症，患病家蚕会出现空头和下痢等症状。本课题组于2005年完成该病毒的基因组序列测定和分析工作，发现其基因组由VD1和VD2两个单链DNA分子组成，VD1含有4个理论的开放阅读框(ORF1，ORF2，ORF3，ORF4)，VD2基因组中含有2个理论的开放阅读框（ORF1，ORF2）。由于该病毒基因组的独特性质，2012年经189个分类委员投票批准，新设定一个二分DNA病毒科，下设一个二分浓核病毒属，而BmBDV是该病毒科中的唯一代表种。　　VD1-ORF4由3318 nts组成，理论上编码一个由1105个氨基酸组成的蛋白质，预测其分子量大小为127 kDa、等电点为5.90，且与DNA聚合酶B家族同源，推测该蛋白质可能是BmBDV病毒编码的一个DNA聚合酶，与病毒DNA的复制及病毒增殖有关。　　为鉴定VD1-ORF4的编码产物及它们的功能，本研究针对VD1-ORF4理论氨基酸序列制备相应抗体，通过PCR扩增VD1-ORF4序列上的两个不同DNA片段，利用原核表达系统表达这两个截短多肽，对获得的原核表达产物进行割胶纯化，将纯化后的抗原分别免疫昆明小鼠，获得针对VD1-ORF4理论氨基酸序列不同抗原表位的抗血清;通过上海Abmart公司，定制VD1-ORF4理论氨基酸序列的单克隆抗体。通过这些抗体对病毒感染的5龄家蚕中肠总蛋白进行免疫印迹分析，发现VD1-ORF4在病毒感染的家蚕中肠中编码多个蛋白，其中包括一个约127 kDa的大蛋白以及70 kDa、53 kDa及45 kDa的小分子量蛋白，目前还不清楚这些蛋白的形成机制。通过免疫共沉淀和质谱技术，对VD1-ORF4编码产物的互作蛋白进行初步分析，并通过GO分析得到其中235个蛋白的生物功能，其具体作用有待于进一步研究。通过免疫荧光实验对VD1-ORF4编码产物进行亚细胞定位，通过PCR扩增杆状病毒来源的极早期基因启动子，构建了该启动子控制的VD-ORF4瞬时表达载体，转染昆虫细胞，激光共聚焦观察发现，其产物大都定位于细胞质中，少部分能进入细胞核中。以上结果，为进一步揭示VD1-ORF4编码产物的功能提供基础。　　为获得VD1-ORF4编码的蛋白，本研究通过杆状病毒表达系统(Baculovirus expressionvector system，BEVS)表达VD1-ORF4来源的3个DNA片段，包括全长片段(3318 bp)以及两个部分长度的DNA片段(1320 bp和2160 bp);为便于重组病毒粒子的鉴定，本研究对野生型杆状病毒穿梭载体(bacmid)进行了改造，将绿色荧光蛋白基因引入到bacmid的非必需位点，进而利用改造后的载体表达VD1-ORF4全长序列及部分序列。Western b1ot分析发现全长片段(3318bp)表达时能在70 kDa处杂交到一条很特异的带，而部分长度片段（1320bp和2160bp）的表达却很不理想，没有鉴定到靶蛋白的表达，推测VD1-ORF4编码的蛋白可能具有特殊的理化性质，不易在BEVS中表达;同时，本研究构建了在杆状病毒极早期基因启动子控制下的，VD1-ORF4的C端与EGFP的N端融合表达的瞬时表达载体，转染昆虫细胞，荧光显微观察发现，视野中能观察到的荧光数量很少，而在只表达EGFP的对照组中，整个视野中布满了绿色荧光，该实验进一步验证了VD1-ORF4不适于在BEVS中表达。　　本研究从分子水平上对VD1-ORF4的编码产物进行了鉴定，首次揭示VD1-ORF4编码127kDa、70 kDa、53 kDa及45 kDa蛋白，并利用BEVS对VD1-ORF4全长及部分片段进行真核表达，为深入研究这些蛋白的功能及其产生机制奠定了坚实的基础，为防控与改造该病毒提供理论依据。