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铁是生物体正常生长不可或缺的元素,而细胞内过量的铁离子会引起Fenton反应而产生ROS,从而导致细胞氧化损伤。已有研究表明生物体中,铁蛋白具有氧化胁迫抗性、调节细胞内铁离子浓度等作用。极端耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)抗氧化基因组序列分析,发现一个的类铁蛋白编码基因(drB0118),已有的研究表明该蛋白失活导致细胞对干燥胁迫敏感,但在调节细胞内铁离子浓度及氧化胁迫抗性的作用尚无报道。本研究通过生物信息学分析、基因突变和异源表达等方法对DrfE蛋白的抗氧化功能进行初步研究,主要取得如下研究结果: (1)利用生物信息学方法,对耐辐射异常球菌DrfE进行生物信息学分析,发现drfE位于耐辐射异常球菌基因组大质粒上,该蛋白由337个氨基酸组成,含有一个与铁蛋白类似保守结构域,属于铁蛋白2超家族。因此,将该蛋白命名为DrfE(Deinococcus radiodurans Ferritin,DrfE)。其氨基酸序列分析表明,该蛋白具有明显的跨膜结构和蛋白疏水区,是一类典型的跨膜蛋白。 (2)为了研究耐辐射异常球菌 drfE的功能,本研究采用融合PCR和体内同源重组的方法成功构建了drfE基因的缺失突变株(ΔdrfE)和功能回补菌株(pdrfE::Δ)。胁迫冲击实验显示,drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌对氯化钠和过氧化氢敏感,80mM H2O2处理30min后,突变株比野生型菌株的生存力低4个数量级,5M NaCl处理6h导致突变株的生存力降低2个数量级,且回补株能够完全恢复突变株ΔdrfE的表型。 (3)对野生型DR、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE::Δ中体内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定的结果表明,在正常培养条件下,drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌CAT和SOD活性下降(突变株的酶活分别下降28.36%和6.42%);而氧化胁迫(80mM H2O2处理30min)条件下,差异尤为显著(突变株酶活下降32.33%和41.30%)。进一步对胞内Fe2+含量进行测定,结果显示drfE基因缺失引起耐辐射异常球菌细胞中胞内Fe2+含量增加了26%,达293μmol/L。 (4)将耐辐射异常球菌DrfE蛋白异源表达在大肠杆菌中,表型分析结果表明,DrfE蛋白明显增强了大肠杆菌对氯化钠和过氧化氢的胁迫抗性。在15mM H2O2处理10min条件下,DrfE蛋白异源表达的大肠杆菌生存力增加了2个数量级,1.5M NaCl处理6h条件下,其生存力增加1个数量级。 总之,耐辐射异常球菌drfE基因在盐和氧化胁迫反应中发挥重要作用,能维持细胞CAT和SOD活性,有效降低胞内Fe2+含量,保护细胞免受氧化损伤,其分子作用机制有待于进一步研究。