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蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)引起,由库蠓(Culicoides)传播的绵羊等反刍动物的一种非接触性虫媒病毒性传染病。该病主要发生于各热带、亚热带和温带国家,给畜牧业造成巨大的经济损失。BTV是呼肠孤病毒科(Rewiriade)环状病毒属(Genus Orbivirus)的代表种,已发现它有24个血清型。由于BLU危害严重,防治困难,被世界动物卫生组织(OIE)确定为必须申报的动物传染病,我国也将其列为一类传染病,采取严格的预防控制措施,防止其传入。本研究采用基因工程技术研制开发基因工程抗原、免疫学技术制备单克隆抗体,在此基础上研制出竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)快速诊断试剂盒。
根据GenBank公布的BTV的VP7基因序列,设计VP7特异引物,通过RT-PCR从BTV基因组中扩增VP7基因,构建pBAD-BTV VP7表达载体,转化LMGl94 E.coli细胞进行蛋白表达,通过对表达条件的优化、SDS-PAGE、Western blot分析,结果表明所表达的VP7蛋白可以与BTV多克隆抗体发生特异性反应。
用纯化的BTV-1与弗氏佐剂乳化后,免疫6周龄BALB/c小鼠。分离免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,经BTV-ELSA、BTV VP7-EIJSA和BHK-ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体与其它病毒无交叉反应,3株单克隆抗体(腹水)的ELISA效价分别达1:512000、1:128000和1:512000,亲和常数分别为5.1×108L/mol、8.6×108L/mol和1.4×109L/mol。
用原核表达的BTV的VP7蛋白作为抗原,包被ELISA板,用HRP标记的抗BTV VP7蛋白的特异性单克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测BTV群特异性抗体的c-ELISA检测方法。用c-ELISA方法检测BTV阳性血清及其它病毒阳性血清,结果表明该方法具有良好的特异性,并且与其它病毒血清无交叉反应。用该c-ELISA方法和进口的ELISA试剂盒同时检测系列稀释的BTV阳性血清,结果表明,两种方法检测的敏感性相当。用该c-ELISA方法和进口的ELISA试剂盒同时检测临床样品366份,结果表明该c-ELISA的特异性和敏感性分别是98.4％和93.5%,两种方法检测结果的符合率为97.5%。结果表明,本研究建立的c-ELISA可以代替进口的c-ELISA试剂盒,可用于BTV血清流行病学调查及进出境检疫。