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甜瓜(Cucumis melo L.)是我国广泛种植的重要经济作物,其香甜的品质深受消费者认可及欢迎。然而,品种、栽培技术及环境等不利因素使设施栽培中成熟时期的甜瓜常出现苦味,对果实品质及商品性造成了不利影响。苦味是甜瓜果实容易出现的性状之一,主要由四环三萜化合物葫芦素B引起。CPPU是生产中常用的细胞分裂素类植物生长调节剂,因其能有效提高甜瓜坐果率而被广泛应用。生产中发现,浓度较高的CPPU会引起果实苦味,但关于CPPU对甜瓜果实苦味物质葫芦素B合成的影响知之甚少。因此,筛选出甜瓜生产中合理的CPPU浓度范围,进一步明确CPPU对甜瓜苦味物质葫芦素B合成的调控机制,对提高设施甜瓜果实品质有重要意义。本试验以生产中常出现苦味的薄皮甜瓜品种‘YMR’和极少出现苦味的品种‘HDB’为试材,分析了葫芦素B在各组织中的积累以及葫芦素B相关基因的时空表达;设置了不同浓度CPPU在植株开花当天喷花,研究其对薄皮甜瓜果实葫芦素B积累的影响;同时构建了果实特异性转录因子CmBt过表达载体,使其在20 mg·L-1CPPU诱导7 d后的果实中瞬时表达,探究CmBt是否响应20 mg·L-1CPPU进而促进甜瓜果实葫芦素B合成。主要研究结果如下:1.以常出现苦味的薄皮甜瓜品种‘YMR’和极少出现苦味的品种‘HDB’的不同组织(子叶、根、茎、叶、卷须、雌花、雄花、花后7d果实)为材料,采用高效液相色谱(HPLC)分析各组织中葫芦素B的积累情况。同时qRT-PCR技术测定葫芦素B合成通路中相关的8个关键基因:葫芦二烯醇合酶基因CmBi、细胞色素P450酶基因(Cm160、Cm170、Cm180、Cm490、Cm710、Cm890)、乙酰基转移酶基因 CmACT以及调控因子(CmBr、CmBt)的表达。两个甜瓜品种葫芦素均在根中积累最多,果实、卷须次之,茎叶及花中较少,子叶中未检测到。并且‘YMR’各组织葫芦素B含量是‘HDB’的2～3倍,推测这可能是‘YMR’常出现苦味瓜的原因。葫芦素B合成基因的表达分别与两个品种各组织中葫芦素B含量趋势一致。2.以‘YMR’和‘HDB’为试材,设置不同浓度CPPU(2.5、5、10及20 mg·L-1),在植株开花当天喷花,以人工授粉为对照,测定果实不同发育及成熟时期(花后7、14、21、28及35 d)葫芦素B的积累及其基因表达。CPPU处理后两个品种的葫芦素B含量在花后7d(幼果期)达到最高,花后14 d骤减,成熟时期葫芦素B含量较低或消失。20 mg·L-1CPPU处理的‘YMR’果实在所有发育时期葫芦素B含量显著高于对照及其他低浓度处理,而20 mg·L-1CPPU处理的‘HDB’果实葫芦素B含量在花后28、35d与对照及其他处理无显著差异,均检测不到葫芦素B存在。qRT-PCR分析表明葫芦素B合成基因CmBi、Cm710、CmACT以及果实特异性转录因子CmBt显著受到20 mg·L-1CPPU 的诱导。3.以‘YMR’为试材,人工授粉为对照,用20 mg·L-1CPPU喷花后,取不同发育时期薄皮甜瓜果实,将果实分为蒂果肉、中果肉、脐果肉、瓜瓤、瓜皮五个部位,测定葫芦素B在果实各部位的分布情况。在果实发育7～21 d(前期),葫芦素B含量均在瓜瓤中最高。在花后28及35 d(果实发育后期),葫芦素B在瓜瓤中显著降低,主要积累于果实的蒂果肉和瓜皮。20 mg·L-1CPPU处理后的果实在每个发育时期各部位葫芦素B含量均显著高于对照,再次表明20 mg·L-1CPPU显著提高了葫芦素B含量。同时,对20 mg·L-1CPPU及人工授粉的薄皮甜瓜成熟果实进行感官苦味评价,分析得出20 mg·L-1CPPU处理后的成熟果实出现苦味瓜比例高达76.25%,对照无苦味瓜出现。进一步说明20 mg·L-1CPPU增加了成熟果实苦味发生的概率。4.以人工授粉花后10 d和20 d的薄皮甜瓜‘YMR’为试材,进行果实圆片孵育实验。设置2.5、5、10及20 mg·L-1CPPU处理,不加CPPU的甘露醇缓冲液为对照,离体测定CPPU对果实葫芦素B含量的影响。葫芦素B呈现先升高降低然后再升高的趋势,且在处理后2 h及12 h,20 mg·L-1CPPU处理的葫芦素B含量显著高于对照。5.克隆CmBt基因414bp,连接酶切后的载体片段,获得用于基因瞬时过表达的重组载体LUC-CmBt。携带目标基因载体的农杆菌EHA105侵染20 mg·L-1CPPU诱导花后7 d甜瓜果实。结果表明,褐色加深,侵染面积越来越大且LUC荧光信号增强。过表达果实中CmBt在侵染后各时间点均极显著高于对照LUC-0,充分证明甜瓜果实瞬时表达体系持久且稳定;与对照LUC-0相比,CmBt过表达的果实中侵染后3-4 d葫芦素B含量极显著升高;葫芦素B合成基因CmBi、CnACT、Cm490表达量在侵染后1d显著高于对照。说明CmBt受20 mg·L-1CPPU诱导,进一步激活葫芦素B合成相关基因调控葫芦素B的积累。综上,薄皮甜瓜苦味物质葫芦素B主要在甜瓜根和果实中积累;高浓度CPPU(20 mg·L-1CPPU)增加果实葫芦素B含量及成熟期果实苦味出现的概率;果实特异性转录因子CmBt响应20 mg·L-1CPPU,激活葫芦素B合成基因进而促进葫芦素B合成。因此,在薄皮甜瓜栽培过程中建议不要加大CPPU使用浓度,在高温等环境条件下应注意配制合理的CPPU浓度。