【摘 要】
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丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)作为级联最后一个组分,含有一个非常保守的T-X-Y基序以特定的时间和空间方式与多种底物相互作用并磷酸化,从而转导上游信号。激活的MPK磷酸化多种细胞质和核底物,研究MAPK的定位、活性状态、稳定性和转录水平具有重要意义。传统的遗传和生化方法已经发现MKKK/MKK/MPK信号模块在控制细胞分裂、发育、激素信号转导和合成、响应非生物胁迫和病原体等方面具有交叉作用。马铃薯
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丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）作为级联最后一个组分,含有一个非常保守的T-X-Y基序以特定的时间和空间方式与多种底物相互作用并磷酸化,从而转导上游信号。激活的MPK磷酸化多种细胞质和核底物,研究MAPK的定位、活性状态、稳定性和转录水平具有重要意义。传统的遗传和生化方法已经发现MKKK/MKK/MPK信号模块在控制细胞分裂、发育、激素信号转导和合成、响应非生物胁迫和病原体等方面具有交叉作用。马铃薯中包含15个MAPKs家族成员,许多物种中的MAPKs家族基因都已被鉴定。本研究通过构建亚细胞定位载体、过表达载体和干扰表达载体,遗传转化马铃薯,从StMAPK4基因的表达位置、对低温的响应和对生理指标的调节方面来鉴定该基因的功能,并对马铃薯StMAPK4基因进行生物信息学分析,取得的主要研究结果如下:1.生物信息学分析表明马铃薯StMAPK4基因长1571 bp,分布于11号染色体,具有6个外显子和5个内含子;该基因CDS序列为1119 bp,包含一个编码372个氨基酸多肽;StMAPK4蛋白总分子量为42685.76 k Da;等电点p I为4.97,是酸性蛋白;总体平均水解性-0.297,StMAPK4基因编码的蛋白为亲水性多肽链。2.通过同源重组的方法构建了p CEGFP-StMAPK4融合蛋白瞬时表达载体,将其转化到烟草叶片中,用激光共聚焦扫描显微镜观察发现:StMAPK4编码的蛋白定位在细胞膜和细胞核。3.通过q RT-PCR分析了低温胁迫下,马铃薯栽培品种“Atlantic”中StMAPK4基因对低温胁迫响应。结果发现StMAPK4基因在根、茎、叶中的含量都有不同程度显著性上调,根中上调了1.27-2.78倍,茎中上调了1.83-2.29倍,叶中上调了2.12-2.98倍,该基因在叶片中表达最稳定。4.通过农杆菌介导的遗传转化获得了转p CE-StMAPK4过表达马铃薯植株及转p BI121-ami R-StMAPK4干扰表达马铃薯植株。StMAPK4在转基因植株中的表达量分析表明,StMAPK4基因的表达量在OE-1、OE-4和OE-5过表达株系中的表达量显著高于非转基因（NT）植株,在OE-2、OE-3和OE-6过表达株系中的表达量极显著高于NT;在干扰表达株系RNAi-3、RNAi-5和RNAi-6中的表达量显著低于NT植株,在RNAi-1、RNAi-2和RNAi-4株系中的表达量极显著低于NT。5.在4℃低温胁迫下,测定了转基因植株的生理指标,结果发现,StMAPK4基因过表达植株（OE-2、OE-3和OE-6）较NT植株中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性显著增强,SOD较NT最高增强了1.16倍,POD较NT最高增强了1.12倍。干扰表达植株（RNAi-1、RNAi-2和RNAi-4）中SOD较NT降低1.19倍,POD较NT降低1.16倍。在过表达植株（OE-2、OE-3和OE-6）中脯氨酸（Pro）含量高于NT植株1.15倍,而在干扰表达植株（RNAi-1、RNAi-2和RNAi-4）中Pro含量明显低于NT植株1.12倍;过表达植株（OE-2、OE-3和OE-6）中丙二醛（MDA）含量最低,较NT下调1.08倍,干扰表达植株（RNAi-1、RNAi-2和RNAi-4）中MDA含量最高,较NT植株上调1.23倍。6.转基因植株表型鉴定结果表明:非转基因马铃薯植株、过表达和干扰表达转基因马铃薯植株在遭受低温胁迫后,都有不同程度受损,其中过表达转基因植株受到的损伤比NT植株小,干扰表达植株与NT相比,其叶片严重萎蔫、干枯。
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