论文部分内容阅读
鼻咽癌是我国南方常见的一种上皮性恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居世界首位,严重危害国人的生命和健康,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种重要的癌基因,其信号转导通路在鼻咽癌发病中具有重要作用。为筛选鼻咽癌EGFR信号通路中磷酸化激活的信号分子,揭示EGFR在鼻咽癌发病中的作用机制,我们进行鼻咽癌EGFR信号通路的磷酸化蛋白质组学研究。一、鼻咽癌表皮生长因子受体的酪氨酸磷酸化蛋白质组学研究应用EGFR配体TGF-α刺激EGFR过表达鼻咽癌CNE2细胞系,对照组CNE2细胞不作TGF-α处理,采用磷酸化蛋白质组学方法(2-DE结合2-D Western blotting)鉴定差异酪氨酸磷酸化蛋白质：即2-DE分离TGF-a刺激和对照组CNE2细胞系的总蛋白质,抗酪氨酸磷酸化抗体2-D Western blotting识别差异酪氨酸磷酸化蛋白质,质谱鉴定差异酪氨酸磷酸化蛋白质,NetPhos软件预测差异蛋白质的酪氨酸磷酸化位点,Pathway Studio 5.0软件构建差异磷酸化蛋白质的信号网络,免疫沉淀结合Western blotting验证3个EGFR信号通路蛋白(ANXA3、KRT8和KRT18)的差异酪氨酸磷酸化水平。结果如下：1、在鼻咽癌CNE2细胞中鉴定了16个EGFR活化相关的酪氨酸磷酸化蛋白质。2、发现并证实ANXA3、KRT8和KRT18为EGFR信号通路相关的酪氨酸磷酸化蛋白质。3、基于鉴定的酪氨酸磷酸化蛋白质,构建了鼻咽癌细胞EGFR相关的酪氨酸磷酸化蛋白质的信号通路网络。二、鼻咽癌表皮生长因子受体的磷酸化定量蛋白质组学研究应用TGF-α和／或EGFR抑制剂PD153035处理CNE2细胞,模拟EGFR信号通路活化和抑制的状态。采用磷酸化定量蛋白质组学方法鉴定差异磷酸化蛋白质：即通过磷酸盐金属亲和色谱(Phosphate Metal Affinity Chromatography, PMAC)富集磷酸化蛋白质,采用2-D DIGE识别差异磷酸化蛋白质点,质谱鉴定差异磷酸化蛋白质,磷酸化修饰位点分析软件预测磷酸化位点,DIGE凝胶磷酸化蛋白质特异性染色对差异磷酸化蛋白质进行验证。基于鉴定的EGFR信号通路磷酸化蛋白质,采用Pathway Studio软件建立EGFR信号通路磷酸化信号网络,采用免疫沉淀结合Western blotting对2个差异磷酸化蛋白质(GSTP1和GRB2)作为EGFR信号转导通路中的信号分子进行了验证。结果如下：1、利用磷酸基团金属亲和纯化技术(PMAC)、2-D DIGE、磷酸化蛋白特异性荧光染色和磷酸化修饰位点分析软件预测等方法鉴定了32个鼻咽癌细胞EGFR信号通路相关的磷酸化蛋白质。2、发现了27个新的EGFR信号通路相关的磷酸化蛋白质。3、基于鉴定的EGFR信号通路相关的磷酸化蛋白质,建立EGFR信号通路相关磷酸化蛋白质的信号网络。本研究鉴定了16个鼻咽癌细胞EGFR信号通路相关的酪氨酸磷酸化蛋白质以及32个鼻咽癌EGFR信号通路相关的磷酸化蛋白质；建立EGFR信号通路相关酪氨酸磷酸化和总磷酸化蛋白质的信号网络。研究结果不仅丰富了EGFR信号通路网络,而且为揭示EGFR在鼻咽癌研究发生发展中的作用机制提供了新的依据。