膀胱癌是泌尿外科最常见的恶性肿瘤，具有早期诊断困难，治疗后容易复发的特点。尽管外科治疗和化疗方法不断进步，但治疗效果仍不十分满意，且其术后的辅助治疗和长期随访也增加了患者的医疗费用和痛苦。因此，探索膀胱癌发生、发展的分子生物学机制和遗传学本质，为膀胱癌的早期诊断及靶向性治疗提供理论基础，是临床和科研上急需解决的重要课题。与其他恶性肿瘤一样，膀胱癌的发生是多基因、多阶段变异累积形成的病理过程。这些基因主要是癌基因、抑癌基因及错配修复基因等。随着分子生物学的发展，原癌基因的激活和抑癌基因的失活导致细胞增殖失控及凋亡缺陷被认为是肿瘤发生的主要机制。抑癌基因功能的丢失可以通过多种途径，DNA甲基化是除缺失和突变之外导致抑癌基因失活的第三种机制，异常甲基化可引起染色体结构、稳定性的改变和基因表达异常，影响细胞的增殖和分化，最终导致抑癌基因表达沉默。因此，DNA甲基化被认为是肿瘤发生的关键事件，在肿瘤相关基因的调控以及肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。 Apaf-1(细胞凋亡蛋白酶活化因子-1)、APC(腺瘤性结肠息肉病相关基因)是两种重要的抑癌基因，分别在细胞凋亡和Wnt信号传导通路调控中发挥着重要作用。新近研究证实Apaf-1、APC在许多正常组织中均有表达，但是在胃癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中却出现表达缺失。有关Apaf-1、APC基因的表达和启动子甲基化状况在泌尿系肿瘤的研究报道较少，本实验拟通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中Apaf-1和APC的启动子甲基化状态，用免疫组织化学的方法回顾性分析膀胱移行细胞癌中Apaf-1和APC的蛋白表达，并分析两种抑癌基因的启动子甲基化状态和蛋白表达与膀胱癌临床生物学行为的关系，探讨膀胱癌发生、发展的机制，为临床早期诊断和预后判断提供依据，并为膀胱癌的分子治疗提供新的靶点。 第一部分抑癌基因Apaf-1及APC在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义 目的：探讨抑癌基因Apaf-1和APC在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义。 方法：收集2001年1月至2003年12月在中山大学附属第一医院泌尿外科确诊为膀胱移行细胞癌患者的临床资料和石蜡组织标本80例，采用免疫组织化学法分析Apaf-1及APC在膀胱移行细胞癌组织标本中的蛋白表达状况及其表达与患者的临床病理及生存期之间的关系。以15例正常膀胱组织的石蜡标本作对照。 免疫组化染色结果判定：Apaf-1、APC的表达以染色强度和阳性细胞百分率的得分之和进行判断：(1)染色强度：阴性为0分；弱阳性为1分；阳性为2分；强阳性为3分。(2)每个标本观察3个有代表性的高倍视野，每个视野计数100个细胞，确定阳性细胞数所占的百分比并取它们的平均值，根据阳性细胞比例，分为阳性细胞0％为0分；<25％为1分；25％～50％为2分；>50％为3分。(1)+(2)之和等于0～3分为不表达或低表达组，4～6分为高表达组。 结果：Apaf-1在BTCC组织和正常膀胱组织中的蛋白阳性表达率分别为36.3％(29/80)和80.0％(12/15)，差异分别有统计学意义(χ2=9.856，P=0.002)。APC在BTCC组织和正常膀胱组织中的蛋白表达率分别为47.5％(38/80)和93.3％(14/15)，差异分别有统计学意义(χ2=10.71，P=0.001)。Apaf-1、APC蛋白表达率均与临床分级、分期明显相关，随肿瘤分级、分期的增加而降低，差异分别有统计学意义(P<0.05)。而Apaf-1、APC蛋白表达率在不同性别、不同年龄、肿瘤单发与多发及有无淋巴结转移之间的比较，差异均分别无统计学意义(P>0.05)。但在复发组与未复发组的比较中，Apaf-1的蛋白表达率分别为20.6％(7/34)和47.8％(22/46)，差异有统计学意义(x2=6.276，P=0.012)，而APC的蛋白表达率分别为52.9％(18/34)和43.5％(20/46)，差异无统计学意义(x2=0.702，P=0.402)。Kaplan—Meier分析显示，Apaf-1不表达或低表达组患者的平均生存时间为48.70±1.58个月，中位生存时间46.5个月；高表达组为67.54±4.09个月，中位生存时间67.3个月，经log—rank生存曲线检验，差异有统计学意义(χ2=21.18，P=0.000)。两组5年总生存率分别为38.7％(24/62)和72.2％(13/18)，差异有统计学意义(x2=6.302，P=0.012)。Kaplan—Meier分析显示，APC不表达或低表达组患者的平均生存时间为51.4±1.8个月，中位生存时间50.0个月；高表达组为65.6±2.9个月，中位生存时间68.4个月，log—rank生存曲线检验，差异有统计学意义(x2=19.29，P=0.000)。两组5年总生存率分别为40.0％(22/55)和68.0％(17/25)，差异有统计学意义(x2=5.39，P=0.020)。生存分析表明Apaf-1、APC基因的高表达组5年生存率高，有显著的生存优势(P<0.05)。 结论： Apaf-1及APC在膀胱移行细胞癌组织中的表达水平明显降低且与临床分级、分期相关，提示Apaf-1及APC基因的表达改变在BTCC的发生、发展中可能具有重要作用。 第二部分 DNA甲基化修饰及SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术平台的建立 目的：建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术平台，为下一步实验做准备。 方法：用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒从新鲜膀胱癌组织中提取DNA，用亚硫酸氢盐进行甲基化修饰后纯化、回收。建立标准品，倍比稀释Apaf-1、APC的标准品，以Apaf-1、APC的甲基化和非甲基化引物进行扩增，建立PCR标准曲线。检验标准曲线的灵敏性和特异性。 结果：构建的Apaf-1及APC标准曲线线性关系良好(扩增反应Ct值与标准品模板起始浓度的对数呈较好的线性关系)。Apaf-1的标准曲线斜率为—3.723，R2=0.999，PCR扩增效率为1.021。APC的标准曲线斜率为—3.3000，R2=1.000，PCR扩增效率为1.009，灵敏度好，特异性强，达到实验要求。 结论： SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术平台建立成功，可用于下一步BTCC组织中Apaf—Ⅰ及APC启动子甲基化状况的样品检测实验。 第三部分膀胱移行细胞癌组织中Apaf-1及APC启动子甲基化状况及临床意义 目的：定量检测Apaf-1及APC在BTCC中的启动子甲基化水平，分析其水平与BTCC临床生物学行为的关系，探讨膀胱癌发生、发展的机制。 方法：收集2006年7月至2008年12月在中山大学附属第一医院泌尿外科行手术治疗，术后病理证实为BTCC患者的组织标本36例，分别从36例新鲜膀胱癌组织及15例新鲜正常膀胱组织中提取DNA，经亚硫酸氢盐进行甲基化修饰后纯化、回收。确定Apaf-1及APC的反应体系及条件，进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量的扩增和检测。每个样本重复3次，根据CT值及样品上样量计算每纳克(ng)DNA中Apaf-1及APC的甲基化拷贝数，析其启动子甲基化量与患者临床资料之间的关系。 结果：Apaf-1在膀胱癌组织和正常膀胱组织中的甲基化率分别为100％(36/36)和6.77％(1/15)，差异有统计学意义(x2=46.31，P=0.000)。APC在膀胱癌组织和正常膀胱组织中的甲基化率分别为69.44％(25/36)和33.33％(5/15)，差异有统计学意义(x2=5.700，P=0.017)。Apaf-1及APC的甲基化量与膀胱癌的分化程度及临床分期有明显的相关性，随肿瘤分级、分期的增加而增加，差异分别有统计学意义(P<0.05)。而Apaf-1及APC的甲基化量在不同性别、不同年龄以及肿瘤单发与多发之间的比较差异无统计学意义(P>0.05)。Apaf-1的甲基化量在初发与复发的患者之间分别为(9.02±2.80)x103 copies/ng和(11.60±3.71)x103 copies/ng，差异有统计学意义(P=0.026)，而APC的甲基化量在初发与复发的患者之间分别(2.55±2.05)x103 copies/ng和(3.47±1.70)x103 copies/ng，差异无统计学意义(P=0.188)，但在有淋巴结转移的患者中APC的甲基化量明显增高。 结论：Apaf-1及APC的启动子高甲基化状况是BTCC发生的早期事件，与BTCC的发生，发展密切相关，在BTCC的早期诊断以及预后判断方面具有重要价值。