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原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的85%～90%,是我国第四位常见恶性肿瘤及第三位肿瘤致死病因,严重威胁我国居民的生命和健康。HCC肿瘤组织中血管丰富,血供模式复杂,存在血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）现象,VM阳性的患者生存期短。目前针对HCC血管生成的靶向治疗主要集中在血管内皮细胞,对由肿瘤细胞组成的VM无效。已有研究发现在HCC肿瘤组织中存在乏氧现象,缺氧环境可通过HIF-1α调控下游靶基因的表达水平和通路,促进肿瘤细胞的增殖和转移,促进肿瘤血管和血管生成拟态形成。Galectin-3参与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和肿瘤血管生成。在肾细胞癌的相关研究中发现:缺氧环境下,HIF-1α可以调控Galectin-3表达水平,但在HCC中尚缺乏相关研究。研究缺氧环境中HIF-1α调控Galectin-3在HCC发生发展和预后中的作用和机制,对预防和治疗HCC转移,延长患者生存时间,提高患者生存质量具有重要意义。目的:本研究分别从组织水平、细胞水平阐明HIF-1α和Galectin-3在HCC肿瘤组织和细胞中表达及其生物学功能,探讨缺氧环境中HIF-1α对Galectin-3的靶向调控作用及其在HCC肿瘤发生发展中作用,阐明HIF-1α和Galectin-3在HCC发生发展和预后中的作用和机制,为HCC的机制研究及临床诊疗研究提供科学依据。方法:选择在吉林大学第一医院进行手术治疗且病理诊断为原发性肝细胞癌的患者作为本研究的研究对象。采用免疫组织化学方法检测HCC肿瘤组织与瘤旁肝组织HIF-1α、Galectin-3、Galectin-9和CD31/PAS的表达水平,分析HIF-1α、Galectin-3和Galectin-9表达水平与患者临床特征、肿瘤血管生成拟态和预后的关系,分析肿瘤组织中HIF-1α与Galectin-3和Galectin-9表达水平的相关性。采用si RNA沉默Galectin-3,细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭、三维培养管腔形成实验确定Galectin-3对HCC细胞生物学功能的影响。采用物理缺氧法,三气培养箱设置1%O2,94%N2,5%CO2模拟缺氧微环境,细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭、三维培养管腔形成实验确定缺氧环境对HCC细胞生物学功能的影响,进一步si RNA沉默HIF-1α和Galectin-3确定缺氧环境中HIF-1α和Galectin-3对HCC细胞的生物学功能的影响。RT-q PCR、Western-blot和CHIP-PCR技术明确缺氧环境下,HIF-1α对HCC细胞中Galectin-3的靶向调控作用,阐明缺氧环境通过HIF-1α调控Galectin-3对肿瘤细胞生物学功能的影响。结果:1.HIF-1α在原发性肝细胞癌中的表达水平及其与预后的关系在202例HCC患者中检测肿瘤组织和瘤旁组织中HIF-1α和CD31/PAS表达水平,HIF-1α在肿瘤组织中表达水平高于瘤旁组织,但差异无统计学意义（P=0.097）,但在53例非肝硬化患者中,HIF-1α在肿瘤组织中表达水平显著高于瘤旁组织（P=0.023）。VM阳性患者HIF-1α阳性率显著升高（P＜0.05）,HIF-1α阴性患者中位生存时间显著延长（Log-Rank P=0.002）。经调整年龄、性别等混杂因素后,肿瘤多发（HR=1.83,95%CI[1.24-2.72]）,肿瘤直径大于5cm（HR=2.23,95%CI[1.48-3.37]）,肿瘤组织HIF-1α阳性表达（HR=2.16,95%CI[1.42-3.30]）是HCC患者不良预后的独立预测因素。2.Galectin-3和Galectin-9在原发性肝细胞癌中表达水平及其与预后的关系在247例HCC患者中检测肿瘤组织和瘤旁组织中Galectin-3和Galectin-9表达水平,Galectin-3在HCC肿瘤组织中阳性率高于瘤旁组织（P＜0.001）,丙肝感染、血清甲胎蛋白≥20ng/ml、脉管浸润、肿瘤组织低分化和VM阳性患者Galectin-3表达水平显著升高（P＜0.05）,Galectin-3低表达者术后中位生存时间较高表达者显著延长（Log-Rank P=0.012）。Galectin-9在肿瘤组织和瘤旁组织中表达水平无显著性差异（P=0.222）。Galectin-9表达水平与患者术后生存时间无关（Log-Rank P=0.185）。经调整性别、年龄等混杂因素后,肿瘤多发（HR=2.02,95%CI[1.41-2.90]）,肿瘤直径大于5cm（HR=1.12,95%CI[1.07-1.19]）,肿瘤组织Galectin-3高表达（HR=1.50,95%CI[1.01-2.24]）是HCC患者不良预后的独立预测因素。在HCC肿瘤组织中,HIF-1α表达水平与Galectin-3表达水平呈正相关性（R=0.167,P=0.043）。3.Galectin-3对原发性肝细胞癌细胞生物学功能的影响沉默Galectin-3后,HCC肿瘤细胞Hep G2和SMMC7721的增殖活力均被明显抑制,且差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:沉默Galectin-3 24h后,Hep G2和SMMC7721细胞凋亡细胞数显著高于对照组（P＜0.05）;细胞划痕实验结果显示:划痕48h后,Galectin-3沉默组Hep G2和SMMC7721细胞迁移率均低于对照组,且差异具有统计学意义（P＜0.05）;Transwell细胞侵袭实验结果显示:Galectin-3沉默组穿过小室的Hep G2和SMMC7721细胞数均少于对照组,其差异具有统计学意义（P＜0.05）;三维培养检测肿瘤细胞血管生成拟态形成情况,结果显示:在Hep G2细胞中,Galectin-3沉默组管腔面积小于对照组,是对照组的0.94倍（P=0.038）;在SMMC7721细胞中沉默组管腔面积是对照组的0.88倍（P=0.001）。4.缺氧环境对原发性肝细胞癌细胞生物学功能的影响缺氧培养SMMC7721细胞24h后可促进SMMC7721细胞增殖活力（P＜0.001）,抑制细胞凋亡（P=0.006）;划痕后48h,缺氧组细胞迁移率是对照组的1.45倍,但差异无统计学意义（P=0.166）;细胞侵袭实验结果显示:缺氧促进细胞侵袭（P=0.001）。三维培养下管腔形成实验结果显示:缺氧促进SMMC7721细胞血管生成拟态形成能力（P=0.003）。5.缺氧环境中HIF-1α和Galectin-3对原发性肝细胞癌细胞生物学功能的影响缺氧环境培养SMMC7721细胞48h后,HIF-1α和Galectin-3 m RNA和蛋白表达水平同时显著上调。缺氧环境下,沉默HIF-1α或Galectin-3 24h后,SMMC7721的增殖活力被显著抑制（P＜0.001）,沉默HIF-1α可增加SMMC7721细胞细胞凋亡数,但差异不具有统计学意义（P=0.352）;Galectin-3沉默组细胞的凋亡数明显增加（P=0.008）;划痕48h后,沉默HIF-1α或沉默Galectin-3均可明显抑制细胞迁移（P＜0.05）;Transwell结果显示:HIF-1α沉默组或Galectin-3沉默组穿过小室细胞数均少于对照组（P＜0.001）;三维培养下管腔形成实验结果显示:沉默HIF-1α或沉默Galectin-3均可明显抑制细胞血管生成拟态形成（P＜0.001）。6.缺氧环境中HIF-1α对Galectin-3的靶向调控作用缺氧环境下,沉默HIF-1α48h后,沉默组HIF-1α和Galectin-3的m RNA和蛋白表达水平均显著下调（P＜0.05）。进一步Ch IP-q PCR证实Galectin-3与转录因子HIF-1α显著富集。结论:1.在非肝硬化患者中,HCC肿瘤组织中HIF-1α表达水平高于瘤旁组织,HIF-1α高表达与血管生成拟态形成有关,HIF-1α阳性患者生存时间短,预后差。2.Galectin-3在HCC肿瘤组织中表达高于瘤旁组织,高表达与血管生成拟态形成有关,高表达患者生存时间短。3.HCC肿瘤组织中HIF-1α与Galectin-3表达水平呈正相关性。4.Galectin-3可以促进Hep G2和SMMC7721细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成拟态形成,抑制细胞凋亡。5.Galectin-3是转录因子HIF-1α调控的靶基因,缺氧环境通过HIF-1α调控Galectin-3参与HCC细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管生成拟态过程。