论文部分内容阅读
重金属是影响食药用菌生长和代谢的重要环境因子,过量的重金属影响食药用菌的生长,而且影响食药用菌的重要活性物质的合成。作为有着悠久历史的食药用菌-灵芝,在栽培过程中深受重金属的影响,其毒性与抗氧化机制有着密切的关系,但目前有关重金属对灵芝影响的分子机制尚不清楚,因此研究重金属对灵芝生长的影响及抗氧化响应机制可以为进一步揭示重金属毒害机理提供理论基础,可为食药用菌栽培过程中重金属污染的控制提供理论依据。Cd、Cu是污染土壤的重金属元素,严重影响着食药用菌的生长及人类的健康,本文以灵芝菌丝体为研究对象,选用Cd、Cu两种重金属对其进行不同处理浓度的培养,探究Cd、Cu诱导氧化应激影响灵芝生长及代谢物积累的机制。方法:采用不同浓度Cd及Cu培养基分别对灵芝菌丝体进行培养,观察不同浓度下灵芝菌落的生长及生物量变化;通过测定不同的Cd、Cu处理浓度下菌丝体内胞内活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶相关基因的基因表达量及抗氧化酶活性,分析Cd、Cu对灵芝菌丝体生理特性及相关基因表达的影响;通过表达纯化GPX蛋白,体外分析Cd、Cu对GPX活性的影响;通过检测灵芝菌丝体内蛋白、多糖含量及总三萜含量分析不同Cd、Cu处理浓度对菌丝体重要代谢产物的影响,并对灵芝三萜合成关键酶Sqs、Osc基因进行基因表达量分析,进而分析Cd、Cu胁迫对灵芝菌丝体生长及代谢的影响。结果:1.Cd与Cu均在低浓度时促进菌丝体生长,高浓度时抑制生长;Cd浓度超过4mg/L,Cu浓度超过60mg/L时抑制菌丝体生长。2.随着Cd、Cu处理浓度的升高,灵芝菌丝体胞内ROS水平、MDA含量均呈上升趋势。当Cd处理浓度达到4mg/L时ROS水平、MDA含量均显著上升;当Cu处理浓度达到20mg/L时,灵芝菌丝体的MDA含量显著上升,达到60mg/L时灵芝菌丝体的ROS显著上升。Cd处理后激活NADPH氧化酶的基因表达,酶活提高,Cd处理浓度达到1mg/L时,APX酶活显著上升,GPX酶活显著下降,CAT、SOD酶在Cd处理浓度分别为1mg/L、10mg/L时,酶活显著上升并达到峰值。Cu处理浓度达到20mg/L时,SOD、CAT、APX、GPX酶活显著上升,当Cu处理浓度达到40mg/L时,SOD、CAT、APX、GPX酶活均达到峰值,随着处理浓度的继续增加呈下降趋势。外源性NADPH oxidase（NOX）酶抑制剂显著抑制Cd引起的ROS积累。3.Cd胁迫会使抗氧化酶基因Sod1、Sod4、Cat、Gpx、Apx基因表达量显著上调;Cu胁迫使Sod1、Sod4、Cat、Gpx、Apx基因表达量显著上调;表达并纯化出GPX蛋白在体外验证Cd显著抑制GPX酶活,而Cu对GPX无显著影响。4.随着Cd、Cu处理浓度的增加灵芝胞内总蛋白含量呈先上升后下降趋势,Cd处理浓度超过1mg/L时随浓度提高总蛋白含0量及总三萜产率均呈下降趋势,Cd处理浓度达到10mg/L时,总三萜产率显著低于对照组,Cd达到40mg/L时,总蛋白含量显著低于对照组;Cu处理浓度达到40mg/L时,灵芝菌丝体多糖、总蛋白及总三萜的含量最高,随浓度提高含量下降,Cu处理浓度达到100mg/L时总三萜产率及蛋白含量显著低于对照组。结论:Cd、Cu离子浓度分别达到4mg/L、60mg/L时,抑制菌丝体生长,影响了总蛋白、灵芝三萜的合成;Cd离子相比较Cu离子对菌丝体生长及代谢产物合成影响更大。Cd在大于4mg/L时,激活了NOX酶活,促进了抗氧化相关基因Sod、Cat、Apx、Gpx的表达,但是抑制了GPX酶活,使抗氧化酶SOD、CAT的活性呈下降趋势,APX酶活上升,胞内ROS水平上升,膜氧化损伤加剧,抑制菌丝体生长,菌丝体内总蛋白、总三萜含量下降;Cu胁迫大于60mg/L时,ROS水平升高,但对NOX酶活无影响,使得了Sod、Apx、Gpx基因的表达上调,APX酶活上升,SOD、CAT、GPX活性均呈下降趋势,膜氧化损伤加剧,菌丝体生长抑制。综上所述,Cd、Cu影响菌丝体生长的机制存在差异,Cd2+可能主要通过抑制GPX酶活性,造成过氧化物积累,从而激活NOX酶活,提高ROS水平从而造成膜损伤MDA积累,从而影响生长及代谢物积累。而铜离子则对GPX影响不显著,相对CAT酶影响更大。因此在生产过程中要根据重金属影响生长和代谢物积累机制的差异采取不同的策略进行控制。