缓激肽对胶质瘤细胞磷酸化CREB、IL-1β和IL-6表达的影响目的血肿瘤屏障（blood tumor barrier，BTB）的存在使到达肿瘤组织的非脂溶性药物的浓度大大下降，因而降低了药物疗效。研究表明经颈内动脉灌注缓激肽（bradykinin，BK）能选择性地开放血肿瘤屏障，不影响正常脑组织，使到达肿瘤组织的药物浓度显著增加。深入探讨缓激肽开放血肿瘤屏障的机制，对于指导应用缓激肽选择性开放BTB转运化疗药物，提高恶性脑肿瘤化疗疗效具有重要意义。目前学者认为缓激肽开放血肿瘤屏障的机制可能是缓激肽与肿瘤细胞上的B2受体结合，使胞浆中Ca²⁺浓度升高，激活一氧化氮合成酶，产生的NO进一步激活鸟苷酸环化酶，产生高浓度的cGMP，已有研究证实NO和cGMP能够增加血肿瘤屏障及血脑屏障的通透性。cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一种重要的核转录因子，受多种信号转导通路调控，CREB的转录激活主要依靠Ser¹³³位的磷酸化，它磷酸化以后可形成二聚体与基因启动子内cAMP反应元件（cAMP response element，CRE）结合，在CREB结合蛋白的协助下，调控脑细胞中多种基因的转录。CREB可诱导肿瘤细胞凋亡，而且在神经细胞发育、突触形成，学习记忆等方面均发挥重要作用，由于CREB在多条信号转导通路中发挥作用和它广泛而又复杂的功能，令其日益受到学者的重视。目前CREB对血脑屏障结构和功能的影响研究甚少。Cruzalegui等研究发现低氧条件可引起内皮细胞内Ca²⁺的短暂升高，进而通过激活钙调蛋白依赖的激酶和细胞外信号相关激酶，启动CREB、c-fos、NF-κB等对氧敏感的转录因子，使紧密连接（tight junction，TJ）相关蛋白在DNA及蛋白表达水平上发生改变，引起血脑屏障通透性增加。有学者研究发现在成纤维细胞中缓激肽能诱导CREB磷酸化，还有文献报道在血管平滑肌细胞、海马的CA1区等处有NO／cGMP／PKG／CREB的信号通路，即NO／cGMP／PKG可以激活CREB；Ca²⁺增加也可以诱导CREB磷酸化。我们拟培养C6大鼠胶质瘤细胞，观察缓激肽是否可以促进胶质瘤细胞内CREB磷酸化及探讨其中的机制。白细胞介素-1β（IL-1β）、TNFα等炎性因子可通过破坏紧密连接，降低微血管内皮细胞电阻，使血脑屏障通透性增加。同时IL-1β还能够诱导其它细胞因子的产生，如TNFα、IL-8等，这些因子都有在一定程度上增加血脑屏障通透性的作用。体外实验发现，IL-1β还可诱导人脑微血管内皮细胞表达内皮粘附分子，后者亦有增加血脑屏障通透性的作用。还有文献报导TNFα、IL-1β可引发缓激肽B2受体的mRNA表达增加，并伴有缓激肽B2受体蛋白的增加。缓激肽可诱导多种细胞如巨噬细胞、人肺腺癌细胞株A549细胞等分泌IL-1β等细胞因子，它是否也能刺激C6胶质瘤细胞IL-1β等细胞因子的表达尚不清楚。Sanagi等研究发现在小神经胶质细胞中，色素上皮衍生因子诱导白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、TNFα的产生是通过激活CREB或NF-κB转录因子介导的。在IL-6、IL-1β、TNFα的启动子中含有DNA结合区CRE序列，表明其基因表达可受CREB调控。我们推测缓激肽可能通过激活CREB来调节IL-1β的表达进而引起血肿瘤屏障的开放。IL-6表达上调虽然与血脑屏障通透性的增加关系密切，但近年来，许多学者发现在人脑胶质瘤组织、胶质瘤细胞株、及正常胶质细胞中都有IL-6的表达，并认为IL-6的异常表达与肿瘤的发生发展和恶性程度密切相关。缓激肽作为一种炎性介质，具有很强的刺激肺泡上皮细胞等多种细胞分泌IL-6的能力，它在开放血肿瘤屏障的同时，是否会导致胶质瘤细胞分泌IL-6上调值得探讨。本文利用免疫细胞化学和western-blot方法观察缓激肽作用下，大鼠C6胶质瘤细胞中转录因子CREB磷酸化的动态变化；并利用RT-PCR技术和放射免疫法观察缓激肽作用大鼠C6胶质瘤细胞后，细胞内及培养液中IL-1β、IL-6的表达变化，及利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术探讨CREB的磷酸化是否介导了缓激肽刺激大鼠C6胶质瘤细胞内IL-1β的表达。材料和方法一、实验材料1、细胞大鼠C6胶质瘤细胞株由中国医科大学细胞生物重点实验室提供。2、主要试剂DMEM、胰蛋白酶购自Gibco公司；胎牛血清购白天津H&Y生物公司；缓激肽购自Sigma公司；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；兔抗鼠CREB及磷酸化CREB多克隆抗体购自Cell Signaling公司；SABC免疫组化试剂盒、DAB显色剂均购自武汉博士德公司；羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG二抗购自北京中山生物技术公司；RNAout，IL-1β、IL-6引物，RT-PCR试剂均购自大连宝生物工程有限公司；siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成；IL-1β、IL-6测定试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所。3、主要仪器细胞培养箱；倒置显微镜；台式低温超速离心机；超声粉碎机电泳仪；转印仪；PCR扩增仪；凝胶自动成像仪。二、实验方法1、细胞培养大鼠C6胶质瘤细胞培养于含10％的灭活胎牛血清的DMEM培养液中，置5％的CO₂、37℃细胞培养箱内培养，1d更换培养基1次，2～3d传代1次。2、免疫细胞化学检测缓激肽作用下CREB蛋白的磷酸化取对数生长期的大鼠C6胶质瘤细胞，经0.25％的胰酶消化后，制成单细胞悬液，以10⁹／L的浓度接种于预先放置有盖玻片的24孔培养板中，置5％的CO₂、37℃细胞培养箱内过夜培养，待细胞生长近单层后，加入1μmol／L缓激肽（终浓度）。分别孵育0、5、10、15、20、30min，弃去培养液，对不同作用时相所得标本进行免疫细胞化学检测。经Motic数码摄像系统采集照片，以Motic images advanced 3．0图象处理软件进行分析。每张切片随机选取400倍物镜下3个视野，计算平均光密度值表示CREB蛋白磷酸化程度。对照组未经缓激肽处理，PBS代替一抗作为阴性对照。3、Western-blot检测缓激肽作用下CREB蛋白的磷酸化接种10⁹／L浓度的大鼠C6胶质瘤细胞于100ml的培养瓶中，培养至对数生长期后，加入缓激肽终浓度至1μmol／L，分别孵育0、5、10、15、20、30min后，弃去培养液。以PBS液洗后，4℃1000r／min离心10min收集细胞，然后进行western-blot检测。所得X光胶片用Chemi Imager 5500 V2．0软件扫描，通过Fluor Chen 2．0软件进行定量分析，测得整合光密度值（integrated density value，IDV）。4、RT-PCR检测缓激肽作用下IL-1βmRNA、IL-6 mRNA的表达PCR引物的设计：（1）IL-1β引物：根据大鼠IL-1cDNA全长序列(GenBank，序列号GI：139286911设计引物。5’端引物为5’-CGATCGCGCAGGGGCTGGGCGG-3’，3’端引物为5’-AGGAACTGACGGTACTGATGGA-3’，目的产物长度为445bp。（2）IL-6引物：根据大鼠IL-6cDNA全长序列（GenBank，序列号GI：7549768）设计引物。5’端引物为5’-CTACGAAGAACTGGCAATATG-3’，3’端引物为5’-AAACCATCTGGCTAQGTAAGA-3’，目的产物长度为207bp。（3）GAPDH引物：根据大鼠GAPDHcDNA全长序列（GeneBank，序列号GI：110347607）设计引。5’端引物为5’-AAGGGCTCATGACCACAGTCC-3’，3’端引物为5’-ACCCTGTTGCTGTAQCCATCC-3’，目的产物长度为461bp。用1μmol／L终浓度的缓激肽分别作用C6胶质瘤细胞0～60min，然后用RNAout试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。扩增后将每一标本的IL-1β或IL-6及GAPDH扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳25min，EB染色，然后用Bio-Rad凝胶成像仪成像，并用Fluor Chen V2．0 Stand Alone软件对图象进行分析，以GAPDH为参照，结果以IL-1β、IL-6／GAPDH的IDV比值表示。5、放射免疫法测定C6胶质瘤细胞培养液内IL-1β、IL-6的含量收集1μmol／L缓激肽分别作用细胞0～60min的培养上清液，由专业人员按说明书操作，自动打印结果。6、siRNA转染及鉴定siRNA设计及合成：大鼠CREB特异性siRNA序列为：Sense：5’-UGACUUAUCUUCUGAUGCATT-3’；Antisense：5’-UGCAUCAGAAGAUAAGUCATT-3’。无关序列的siRNA（和CREBsiRNA含有相同组成的碱基，但随机排列的siRNA）作为阴性对照，序列为：Sense：5’-UAUAGCUUACUAGCUCUUGTT-3’；Antisense：5’-CAAGAGCUAGUAAGCUAUATT-3’。利用RNA干扰技术，以CREB为靶基因，将体外化学合成的CREB序列特异性双链小干扰RNA和无关序列的siRNA分别与Lipofectamine2000结合后转染细胞，用westem blot分析CREB蛋白的表达水平。7、RT-PCR检测CREB特异性siRNA转染C6细胞后，缓激肽作用下IL-1βmRNA的表达细胞转染CREB特异性siRNA（80nM）72h后，分别用1μmol／L终浓度的缓激肽作用C6胶质瘤细胞0、5、10、15、30、60min，并设立转染前空白对照。然后用RNAout试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，然后用Bio-Rad凝胶成像仪成像，并用Fluor ChenV2．0 Stand Alone软件对图象进行分析，以GAPDH为内参照，结果以IL-1β／GAPDH的IDV比值表示。8、放射免疫法检测CREB特异性siRNA转染C6细胞后，缓激肽作用下培养液中IL-1β的表达细胞转染CREB特异性siRNA（80nM）72h后，分别收集缓激肽作用C6胶质瘤细胞0、5、10、15、30、60min的细胞培养上清液，并设立转染前对照。由专业人员按说明书操作。9、统计学方法处理所有数值以（?）±s表示，实验数据采用SPSS 11．5统计软件进行t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果1、1μmol／L缓激肽作用C6胶质瘤细胞，缓激肽作用5到30min的各时间点均能检测到CREB的磷酸化（P＜0.01），其中以15min的磷酸化最强（P＜0.01）。2、RT-PCR结果显示缓激肽作用15min后，IL-1βmRNA的表达水平较对照组显著升高（P＜0.05），然后逐渐下降；放射免疫法结果亦证明C6胶质瘤细胞在缓激肽作用15min后，其细胞培养上清中IL-1β的活性最强。3、RT-PCR结果显示，在缓激肽作用于C6胶质瘤细胞的不同时间点（0，5，10，15，30，60min）均有IL-6mRNA的表达，各组间比较无显著性差异（P＞0.05）；同时间点的放射免疫法结果显示，细胞培养液中未检测到IL-6的表达。4、CREB序列特异性siRNA转染细胞72h后，较强地抑制CREB蛋白的表达，而无关序列的siRNA对CREB蛋白表达水平无明显的抑制作用。RT-PCR和放射免疫法结果均显示CREBsiRNA干预C6细胞后，并未改变缓激肽刺激IL-1β表达的作用。结论1、缓激肽可促进大鼠C6胶质瘤细胞中转录因子CREB的磷酸化，此作用可能与其促进血肿瘤屏障的选择性开放有关。2、缓激肽可刺激大鼠C6胶质瘤细胞中IL-1β的分泌增强，IL-1β的表达上调可能在缓激肽增加血肿瘤屏障通透性的过程中发挥一定作用。3、缓激肽作用C6胶质瘤细胞60min以内未引起IL-6的表达增强，这为缓激肽临床应用的安全性提供了有利的实验依据。4、化学合成的CREBsiRNA可有效抑制C6胶质瘤细胞中CREB的表达，这为研究CREB在中枢神经系统的功能提供了新方法；CREB可能未参与缓激肽刺激C6细胞IL-1β表达的信号转导过程。