HN-ZMZ-1基因克隆及农杆菌转化研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jie_er
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大豆是我国主要的粮食作物之一,也是日常生活所需的蛋白质和植物油的主要来源。利用基因工程技术培育高产、优质的大豆品种可以在一定程度上缓解我国对大豆进口的依赖性,对满足人们日益增长的产量和品质要求意义重大。光合作用是产量形成的关键因素,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶(SBPase)是光合卡尔文循环中控制碳流通的关键酶,还关系到Ru BP的再生及碳水化合物的合成。本研究首先以大豆品种沈农9和Williams82为试验材料,对农杆菌介导的大豆遗传转化体系进行了优化,以期提高抗性丛生芽诱导率。然后利用优化的农杆菌转化体系转化克隆的大豆SBPase基因,并将该基因命名为HN-ZMZ-1,最后对T0代阳性植株初步验证。本研究将为建立高效、稳定的大豆转化体系提供基础,及HN-ZMZ-1基因功能的深入研究、高产大豆育种实践提供理论基础。主要研究结果如下:1.采用大豆子叶节划伤与不划伤两种处理研究对抗性丛生芽诱导的影响,结果表明划伤子叶节比不划伤子叶节能获得更高的抗性丛生芽诱导率,两者差异显著。农杆菌侵染外植体过程中,采用0.5 MP的真空渗透3 min能够提高大豆抗性丛生芽诱导率。共培养过程先暗培养3天,再光照培养2天有利于抗性丛生芽的诱导。6-BA浓度为1.75 mg′L-1时,大豆抗性丛生芽诱导率达到最高。2.本研究从大豆基因型Williams 82叶片中克隆SBPase基因,命名为HN-ZMZ-1。序列分析表明,该基因全长为1,399 bp,有一个1,164 bp的编码框,共编码387个氨基酸,分子式为C1864H2951N489O573S11,蛋白质分子量为41.7k Da,等电点为6.05,属于磷酸酶家族成员,与菜豆属、豇豆属亲缘关系较近。同时构建了HN-ZMZ-1基因的植物表达载体pEarleyGate100-HN-ZMZ-1,含有筛选标记Bar基因和Kan,并转入根癌农杆菌菌株GV3101中,用于后续大豆遗传转化。3.使用含有表达载体pEarleyGate100-HN-ZMZ-1的农杆菌菌株GV3101转化Williams 82,经过抗性丛生芽诱导、伸长、生根、炼苗和移栽等步骤,获得移栽成活的抗性植株52株。通过PCR检测共获得6株T0代阳性植株,包括转HN-ZMZ-1基因4株(Tr),转空载体2株(Tr-CK)。对转HN-ZMZ-1基因植株进行荧光定量PCR分析,结果表明转基因植株HN-ZMZ-1基因转录表达量显著高于对照,分别为对照的1.58倍、3.29倍、3.9倍和3.22倍。
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