本试验对不同益生菌菌株进行筛选,选择耐受性较强的益生菌菌株在绿豆糖化液中进行富集,并以冰淇淋为载体探究其在冻藏过程中存活状态的变化及其进入人体后对冷凉性肠易激腹泻症状的抑制作用和对肠道菌群的影响,主要研究内容如下:1.菌种的筛选:对植物乳杆菌Lp-01、保加利亚乳杆菌Lb-01、青春双歧杆菌Bba-02、长双歧杆菌BL-01四株菌进行筛选,通过冷冻和复苏以及在不同pH环境和不同胆碱盐浓度环境下的处理,筛选出抗逆性较高的菌种。经考察,植物乳杆菌Lp-01、青春双歧杆菌Bba-02的耐受性较好,命名为组合菌LB,将用于后续冷冻保藏试验。2.组合菌LB富集条件的优化:针对不同绿豆汁浓度、不同高温淀粉酶添加量、不同培养温度和不同培养时间进行富集条件的优化,以培养液中的活菌数为响应值优化出最佳富集条件为:植物乳杆菌Lp-01与青春双歧杆菌Bba-02接种比为1:1,培养温度39.5℃,培养时间18.5h,此优化方案下,培养液中活菌数实际值为6.79×1011cfu/mL。3.组合菌LB冻藏过程中的存活状态:测定组合菌LB以冰淇淋为载体,经冷冻保藏后的存活率以及菌种耐酸和耐胆盐的能力。分别在-20℃和-40℃条件下贮藏LB冰淇淋,90d内冰淇淋中组合菌LB数量级由9.94分别下降至7.18和6.79。菌种活力随着冷冻贮藏天数的增加呈现先下降后回升,然后逐渐趋于平稳的趋势,65d后,两种温度下冻藏的组合菌耐酸能力和耐胆碱盐能力逐渐趋于平稳,存活率分别稳定在20%和72%-73%左右。4.组合菌LB对冷凉性腹泻的抑制作用:食用冷食会导致部分小鼠腹泻,但组合菌LB可以缓解冷凉性敏感小鼠的腹泻症状。试验过程中高剂量组小鼠的稀便率在各组中降低幅度最大,降低了 3.11%,腹泻指数(10-1)由0.52下降至0.19,降低了 0.33,说明剂量范围内组合菌LB浓度越高对小鼠冷凉性腹泻的抑制效果越强。5.高通量分析组合菌LB对冷食小鼠肠道菌群的影响:通过高通量测序分析法对不同组别小鼠的粪便菌群进行分析,发现高剂量组的ACE值和Chao1值最高,分别为69987.29和27098.77,说明服用了 LB冰淇淋的小鼠肠道菌群丰度较未服用益生菌的小鼠有所增加。根据OTU韦恩图和主坐标分析可知,中剂量组与对照组菌群相似度最为接近,而空白组与对照组相似度差异最大。服用了组合菌LB的小鼠肠道菌群在门水平构成上拟杆菌门占比下降而厚壁菌门占比增高;在属水平构成上乳酸菌属、艾克曼氏菌属、布劳特氏菌属等占比增大,菌群结构发生改变,说明冻藏后的组合菌LB可以在小鼠肠道中起到调节作用。