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甲基汞是严重危害人类健康的蓄积性环境污染物。它对神经系统具有强烈的毒作用。处于发育阶段的脑对其神经毒性作用尤其敏感。长期接触环境低剂量甲基汞对胎、幼儿脑发育损伤及其机制的研究倍受学者关注。多年来，我们在以往课题研究的基础上，认为甲基汞致脑发育损伤与其活化特殊信号分子，抑制发育阶段神经元的增殖，诱导细胞凋亡相关基因表达，促进发育阶段神经元的死亡（凋亡和坏死）有密切关系。本研究建立长期接触低剂量氯化甲基汞致大鼠脑发育损伤动物实验模型，探讨氯化甲基汞致脑发育损伤与信号转导通路中心分子PKC亚类表达及活性变化之间的关系。结果表明大鼠长期接触低剂量氯化甲基汞随其子代脑汞含量增加，神经细胞凋亡率明显增加，PKC(α和δ)表达增强，PKC(γ)表达下调，PKC活性呈增高趋势。本研究有助于胎幼儿对甲基汞神经毒作用易感性的解释，对深入探讨甲基汞神经毒作用机制具有重要的理论意义。1．建立长期接触低剂量氯化甲基汞致脑发育损伤大鼠动物实验模型雌性Wistar大鼠，体重120±20g。随机分为实验和对照组，每组30只。实验组大鼠从妊娠前90d至仔鼠出生后30d连续喂饲含有不同剂量（0.75、1.50和3.00 mg MMC /kg饲料）氯化甲基汞的普通饲料，对照组给予普通饲料。经上述剂量染毒后，实验组Ⅰ(0.75mg MMC /kg饲料)母鼠产子数和仔鼠体重与对照组相比没有明显差异（数据未列），实验组Ⅱ(1.5mg MMC <WP=103>/kg饲料)和实验组Ⅲ(3.0mg MMC /kg饲料) 母鼠产子数和仔鼠体重低于对照组，仔鼠外观无异常表现。1.1 脑汞含量测定仔鼠出生后第3、7、14、21和30d，断头处死，取出脑组织，分离大脑、小脑和海马，精确称重后编号记录。上述部位仔鼠脑组织汞含量采用干烧法，冷原子吸收测汞仪进行测定。结果发现不同脑区（大脑、小脑和海马）脑汞含量无明显差异(p>0.05)。各实验组生后不同时间仔鼠脑汞含量明显高于相应对照组(p<0.05)。各实验组仔鼠脑汞含量随母鼠接触剂量的增高而有不同程度升高（p<0.05）。同一实验组内仔鼠脑汞含量随生后时间的延长逐渐升高，在生后30d达峰值。上述结果表明甲基汞可透过血脑屏障蓄积于仔鼠脑内，且仔鼠脑汞含量与母鼠接触剂量与之间存在一定剂量反应关系。1.2氯化甲基汞致脑发育损伤形态学研究1.2.1氯化甲基汞致大鼠不同发育阶段脑组织形态结构改变实验组和对照组仔鼠按预定时间断头处死，常规制备石蜡切片。脑切片经HE染色，在光镜下观察发现仔鼠大脑、小脑和海马部分神经元体积缩小，核固缩等凋亡形态学改变，这种变化尤以小脑蒲肯野细胞最为明显。1.2.2 氯化甲基汞诱导大鼠不同发育阶段脑神经细胞凋亡上述脑切片采用荧光标记DNA片断分析试剂盒ApoAlertTM DNA Fragmentation Assay Kit检测长期接触低剂量氯化甲基汞对不同发育阶段仔鼠不同脑区（大脑、小脑和海马）神经元凋亡的影响。结果显示，实验组和对照组生后不同时间点仔鼠脑神经元都存在凋亡。大脑、小脑和海马神经元凋亡率随仔鼠脑汞含量的升高而增加，且均明显高于相应对照组（p<0.05）。表明长期接触低剂量氯化甲基汞所致脑发育损伤与其诱导神经元过度凋亡有关。 <WP=104>2. 氯化甲基汞对大鼠不同发育阶段仔鼠脑PKC亚类表达的影响2.1氯化甲基汞对大鼠不同发育阶段仔鼠PKC亚类mRNA表达的影响采用原位杂交方法检测不同发育阶段仔鼠不同脑区PKC亚类mRNA表达变化。PKC(α,βⅠ,γ和δ)在大脑主要分布在皮质外粒层、外锥体层、内粒层、内锥体层和多形层的锥体细胞和粒细胞中；在海马主要表达于锥体细胞；在小脑表达于皮质的Pukinje细胞和颗粒细胞。各实验组和对照组仔鼠脑(大脑、小脑和海马) PKC(α,βⅠ和γ)的表达随生后时间的延长而升高；仔鼠出生早期即有δ亚类高水平表达，其后增高不明显。实验组仔鼠脑PKC(α和δ)表达随仔鼠脑汞含量增加而增高，并明显高于相应对照组(p<0.05)，而PKC(γ)表达降低，PKC(βⅠ)表达无明显变化。2.2氯化甲基汞对大鼠不同发育阶段仔鼠PKC亚类蛋白表达的影响采用免疫组化和免疫印迹法检测不同发育阶段仔鼠不同脑区PKC亚类蛋白表达。发现在蛋白质水平上，PKC(α,βⅠ,γ和δ)的表达与mRNA表达在各脑区的细胞定位一致，表达变化趋势相同。综上，说明⑴不同PKC同工酶在脑发育过程中作用不同。⑵长期接触低剂量氯化甲基汞可影响不同发育阶段仔鼠脑内PKC某些亚类的表达，表达变化具有亚类特异性。⑶甲基汞致脑发育损伤可能与其影响PKC亚类表达有关。究竟有哪些机制参与，使MMC对PKC亚类表达产生不同的影响还有待于进一步研究。3. 氯化甲基汞对不同发育阶段仔鼠脑PKC活性的影响采用改良的Takai方法测定不同发育阶段仔鼠脑组织胞浆和胞膜PKC激酶活性。结果发现：随生后时间的延长，实验组和对照组仔鼠脑组织胞浆和胞膜PKC活性都呈现出逐渐增高的趋势，各个脑区的变化趋势相近。实验组生后不同时间仔鼠（大脑、小脑和海马）胞浆和胞膜活性均高于相应对照组，其中仅实验组ⅠPND3,7和14d、实验组Ⅱ和实验组Ⅲ仔鼠小脑胞浆和胞膜活性明显高于对照组(p<0.05)。实验ⅡPND21/PND30和实验组Ⅲ仔鼠海马胞浆和胞膜活性与对照组相比差异显著(p<0