目的:本研究在国家自然基金面上项目:基于冰冻切片-显微切割-液质联用的牛蒡子药材发育过程牛蒡苷积累规律研究（81773852）和国家自然基金面上项目:以牛蒡子为例中药材质量标志物体系构建与机制研究（81874338）课题资助下,前期走访调查了牛蒡子药材全国各个产地,并通过对牛蒡子文献调查研究,并结合对牛蒡子药材的市场调查,产地调查,明确了牛蒡子不同产区资源分布情况,目的在于规范化牛蒡子药材市场秩序,实现中药材产业发展的规范化、科学化。对全国不同产地30批次以及采自辽宁中医药大学大连校区辽宁省中药材重点品种保护圃的30批次牛蒡子药材进行显微特征指数的测定,通过液质联用UPLC-Q-TOF-MS技术对不同生长时期的牛蒡子果皮样品中牛蒡苷等化学成分以及次生代谢产物进行定量分析与比较,结合了课题组前期对牛蒡子全基因组进行测序的结果,选取了牛蒡全基因组和菊科其它四个物种的全基因组,对牛蒡基因组进行了比较分析,旨在对石细胞这一显微特征的形成机制进行初步的解释,探明牛蒡子内果皮石细胞这一显微特征标志物的生物学形成机制,为中药材分子鉴定提供新的思路与方法。材料与方法:1.材料在牛蒡子不同产区资源分布研究中课题组成员在安徽亳州中药材市场,河北安国中药材市场,成都荷花池中药材市场,广西玉林中药草材市场收集来自22家商铺的40份牛蒡子药材样品。并走访辽宁省宽甸县,吉林省岫岩县,黑龙江省五常县,陕西省蒲城县,陕西省渭源县五个在牛蒡子主要产区,在产地农户收集了20份牛蒡子药材样品。同一产地牛蒡子药材为30批次2019年7月至10月采自辽宁中医药大学大连校区辽宁省中药材重点品种保护圃（E 121°52′38.06″,N 39°03′46.59″）的牛蒡子,不同产地30批次牛蒡子采自全国不同省市,均由辽宁中医药大学康廷国教授、许亮教授鉴定为菊科植物牛蒡（Arctium lappa L.）的干燥成熟果实。激光显微切割-液质联用实验需要的牛蒡子以及进行基因表达分析的牛蒡子按牛蒡子发育过程的五个生长阶段分时分段采集于辽宁中医药大学大连校区辽宁省中药材重点品种保护圃（E 121°52′38.06″,N 39°03′46.59″）,包括花蕾期,初花期,盛花期,花末期和成熟期,进行动态取材。2.方法2.1牛蒡子不同产区资源分布研究包括对本草文献,近代专著,各版中国药典,各省的中药材标准,进行汇总整理。对我国各大中药材市场进行实地调查,对来自22家商铺共40份牛蒡子药材,进行千粒重,瘪瘦率,掺杂率统计。并对牛蒡子的主要产地进行实地调查,对产地收集20份牛蒡子药材进行千粒重,瘪瘦率,掺杂率统计。2.2显微特征指数的测定考虑到影响所制备样品混悬效果的因素主要有样品重量、粉碎粒度等,并且各因素的考察水平有所不同,故本实验采用均匀设计法考察显微定量法的优化条件,得到优化条件为样品称样量450 mg,甘油量5 ml,使用该条件,取所有牛蒡子样品各3份,按上述所得均匀优化的条件进行操作,记录每张装片下的石细胞的个数和面积（万μm2）,按照显微特征指数公式P=（X×V）/（V’×W）,按照公式分别计算出石细胞个数特征指数和石细胞面积特征指数,并计算出平均值和RSD。采用HPLC法,对同一产地30批次及全国不同产地30批次牛蒡子中牛蒡苷含量进行定性定量分析,将数据导入SPSS软件进行相关性分析。2.3通过液质联用UPLC-Q-TOF-MS技术对不同生长时期的牛蒡子果皮样品中牛蒡苷等化学成分以及次生代谢产物进行定量分析与比较,以揭示指标性成分牛蒡苷的大量积累生长时期,以及主要存在于牛蒡子内果皮部位的石细胞的物质积累规律;通过对辽宁中医药大学药用植物园种植的牛蒡进行动态取材,选取五个不同时期新鲜牛蒡子药材,制作冰冻切片,通过激光显微切技术割捕获各个时期牛蒡子的内果皮石细胞,以达到精确捕获牛蒡子果皮石细胞这一显微特征标志物样品的目的;运用参考蛋白序列对牛蒡子和其他菊科植物基因组蛋白文件进行blast比对（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）,参数E＿value为1e-5;再提取identity>=50,align＿ratio>=50%的蛋白;应用Pfam＿scan搜索蛋白是否含有对应结构域。含有完整结构域的基因作为候选基因,提取选择的候选基因进行表达量的分析。这一系列实验旨在初步探明石细胞这一显微特征结构的机制。结果:1.通过对五个省分的牛蒡子产地调查,结合对20份牛蒡子药材千粒重,瘪瘦率,掺杂率进行统计,在课题组成员查看产地农户对牛蒡子采收加工过程中发现,通过风选对牛蒡子进行去杂质,农户对杂质的过筛不够彻底,或者没有风选筛出的瘪干的牛蒡子,牛蒡子药材中杂质和瘪瘦牛蒡子偏多,其掺杂率和瘪瘦率较高,导致牛蒡子千粒重的偏低。2.在同一产地30批次牛蒡子显微特征指数与牛蒡苷含量相关性研究中,Y:牛蒡苷含量;X1:石细胞个数显微特征指数;X2:石细胞面积显微特征指数。Y=-0.365X1+27.196,r=-0.9843 P=0.000,Y=-0.3514X2+26.707,r=-0.9902 P=0.000,二者均有显著的统计学意义,两组数据不仅有显著的相关性,且呈负相关,即牛蒡子内果皮石细胞个数和面积显微特征指数的数值越大,其指标性成分牛蒡苷的含量越低。3.在不同产地30批次牛蒡子显微特征指数与牛蒡苷含量相关性研究中,Y=-0.2307X1+17.582,r=-0.909 P=0.000,Y=-0.2225X2+17.157,r=-0.899 P=0.000,二者均有显著的统计学意义,两组数据不仅有显著的相关性,且呈负相关,即牛蒡子内果皮石细胞个数和面积显微特征指数的数值越大,其指标性成分牛蒡苷的含量越低。4.在UPLC-Q-TOF-MS法测定分析牛蒡子果皮5个不同发育阶段成分实验中,共观察到33个主要色谱峰,鉴定了其中32个的可能结构,主要为氨基酸、酚酸（绿原酸等咖啡酸衍生物）、木脂素类成分及脂肪酸类成分。鉴定出来的成分中,包括氨基酸类（1个）、酚酸类（8个）及木脂素类（19个）,脂肪酸类（4个）;其中第一时期鉴定到29个化合物,第二时期果皮鉴定到32个化合物,第三时期果皮鉴定到32个化合物,第四时期33个化合物,成分种类最多。第五时期牛蒡子中包含32个化合物。5.在牛蒡子内果皮石细胞形成相关基因生物信息学分析中,通过牛蒡基因组与其他菊科四个物种的全基因组进行比对和分析,重点选取了4CL、C4H、CCOAOMT、CCR、PAL、ACT、C3H、CAD、COMT、CSE、DIR、F5H、HCT、LAC、PLR、POD、PPO、SIRD这18个基因家族,通过表达丰度分析以及相关性分析,比较皮尔逊相关系数以及P值,筛选出与木质素累积和石细胞的形成高度相关的基因:4CL,HCT,DIR和LAC四个基因。结论:1.通过对产地牛蒡子药材进行统计,发现牛蒡子药材主要依据掺杂率、千粒重、瘪瘦率,划分为选货与统货两个规格。2.在同一产地以及不同产地30批次,共计60批次的牛蒡子药材,牛蒡子显微特征指数与牛蒡苷含量相关性研究中,石细胞个数显微特征指数与石细胞面积显微特征指数与牛蒡苷含量呈高度负相关,2020版《中华人民共和国药典》一部规定:牛蒡子药材含牛蒡苷(C27H34O11)不得少于5.0%。由实验结果可知,符合国家标准的牛蒡子药材其个数显微特征指数不应高于60.81个/mg,面积特征指数不应高于61.77万μm2/mg。3.在UPLC-Q-TOF-MS法测定分析牛蒡子果皮5个不同发育阶段成分实验中:在分析检测方面,在色谱分离方面不同批次的牛蒡子果皮中提取液样品得到了比较良好的总离子流色谱图,各峰的分离度均比较良好;在质谱数据方面,负离子扫描模式下响应值好于正离子模式,检测质量精度良好,能满足通过精确质量数去鉴定分子式、碎片元素组成的要求。最终从5个不同批次牛蒡子果皮中观察到33个主要色谱峰,鉴定了其中32个的可能结构;再将观察到的主要化合物（包括未鉴定的Unknown）以UNIFI软件进行选择离子响应强度对比比较,鉴定结果主要为氨基酸、酚酸（绿原酸等咖啡酸衍生物）、木脂素类成分及脂肪酸类成分。4.在牛蒡子内果皮石细胞形成相关基因生物信息学分析实验中,运用参考蛋白序列对牛蒡子和其他菊科植物基因组蛋白文件进行blast比对,含有完整结构域的基因作为候选基因。经过表达量的分析以及相关性的分析,最终在结果中筛选了相关系数cor大于0.7,P值小于0.05的四个基因:4CL,DIR,HCT,LAC。这些基因可以为牛蒡子石细胞的分子形成机制提供重要的研究方向,牛蒡子内果皮石细胞的形成和指标性成分牛蒡苷化学成分含量二者的负相关也初步得以阐明。