论文部分内容阅读
第一部分内质网应激介导的自噬在草酸钙晶体所致肾小管上皮细胞损伤中的效应及机制研究目的:观察草酸钙（Calcium Oxalate,CaOx）晶体干预肾小管上皮细胞后是否可以激活内质网应激和自噬,探讨内质网应激在细胞-晶体反应中对自噬的调节机制,阐明内质网应激介导的自噬在草酸钙晶体所致肾小管上皮细胞损伤中的调控作用。方法:使用草酸钙晶体和肾小管上皮细胞建立细胞-晶体反应体系,采用不同浓度的草酸钙晶体（0,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mmol/L）干预肾小管上皮细胞24h和2.0 mmol/L草酸钙晶体干预肾小管上皮细胞不同的时间点（0,3,6,9,12,24 h）,通过Western blot技术检测各组中内质网应激标志蛋白GRP78和自噬标志蛋白LC3B（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）的表达情况。应用内质网应激激活剂衣霉素（Tunicamycin,TM）和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4-PBA）预干预肾小管上皮细胞3h以调控内质网应激水平。将细胞分为4组:正常对照组（NC;使用完全培养基培养）;草酸钙晶体组（CaOx;含2.0 mmol/L草酸钙晶体的完全培养基培养）;草酸钙晶体+4-苯基丁酸处理组（CaOx+4-PBA;2.0 mmol/L 4-PBA预干预3h后,更换为含2.0 mmol/L草酸钙晶体的完全培养基培养）;草酸钙晶体+衣霉素处理组（CaOx+TM;2.0μg/mL TM预干预3h后,更换为含2.0 mmol/L草酸钙晶体的完全培养基培养）。24h后,通过Western blot、免疫荧光技术评估内质网应激和自噬的活性,阐明草酸钙晶体诱导的内质网应激发生机制及其对自噬活性的调控作用。通过调节细胞-晶体反应体系中的内质网应激和自噬活性,利用光学显微镜观察各组细胞内草酸钙晶体黏附情况、ELISA试剂盒检测细胞上清液中炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）的表达水平、TUNEL染色检测细胞凋亡、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测细胞上清液中乳酸脱氢酶的表达水平。从而探讨内质网应激介导的自噬在草酸钙晶体所致肾小管上皮细胞损伤中的调控作用。结果:随着草酸钙晶体刺激浓度和干预时间的增加,内质网应激标志蛋白GRP78和自噬标志蛋白LC3B（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）的表达水平均逐渐增加,且在2.0 mmol/L、24h时达到最大值。使用内质网应激激活剂TM和内质网应激抑制剂4-PBA可有效调节草酸钙晶体诱导的内质网应激水平,且自噬活性的变化与内质网应激水平正相关。与此同时,4-PBA处理可显著减轻草酸钙晶体诱导的细胞晶体黏附、炎症因子IL-1β的表达、乳酸脱氢酶LDH的分泌和细胞凋亡,而TM处理则进一步加重了草酸钙晶体诱导的细胞晶体黏附、炎症因子IL-1β的表达、乳酸脱氢酶LDH的分泌和细胞凋亡。结论:1.明确了草酸钙晶体诱导肾小管上皮细胞产生内质网应激和自噬的最佳浓度和时间点。2.草酸钙晶体可以诱导肾小管上皮细胞发生内质网应激,进而通过内质网应激介导自噬的激活。3.应用内质网应激激活剂TM和内质网应激抑制剂4-PBA,能够有效调节草酸钙晶体诱导的内质网应激水平,进而调控自噬。4.抑制内质网应激介导的自噬可以有效减轻草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤。第二部分内质网应激介导的自噬在大鼠草酸钙肾结石形成中的调控作用及机制研究目的:建立大鼠草酸钙肾结石模型,探讨内质网应激介导的自噬在大鼠草酸钙肾结石形成及细胞凋亡的作用机制。方法:采用乙二醇（EG）饮水法诱导建立大鼠草酸钙肾结石模型,并使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4-PBA）和自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）调控内质网应激和自噬的水平。选择28只4-6周龄,体重180-200g的雄性Sprague-Dawley大鼠,适应性喂养一周后,将实验大鼠随机分为四组（7只/组）:正常对照组（Control;使用正常饮用水喂养）,结石模型组（EG;含1%乙二醇的饮用水喂养）,结石模型+4-苯基丁酸治疗组（EG+4-PBA;含1%乙二醇的饮用水喂养+灌胃给与4-PBA（100 mg/kg/d））,结石模型+氯喹治疗组（EG+CQ;含1%乙二醇的饮用水喂养+腹腔注射CQ（60 mg/kg/d））。4周后,收集各组大鼠肾组织,应用Western blot、RT-qPCR和免疫组化技术检测各组大鼠肾组织中自噬标志蛋白LC3B（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）、BECN1、p62和内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP、caspase12、p-PERK、p-eIF2α的表达情况;通过透射电镜观察各组大鼠肾脏中的自噬泡数量。使用Western blot技术检测各组大鼠肾组织凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及Cleaved-caspase3的表达情况;TUNEL染色法检测各组大鼠肾小管细胞的凋亡情况。使用代谢笼收集大鼠24h尿液,通过ELISA试剂盒检测各组大鼠尿液中肾损伤分子-1（Kidney injury molecule 1,Kim-1）和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的含量。通过大鼠下腔静脉收集各组大鼠循环血液,应用全自动生化仪检测各组大鼠血清肌酐（Creatinine,CRE）及尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）的水平。使用Von Kossa硝酸银染色法检测各组大鼠的肾内晶体沉积情况及肾组织的病理学变化。结果:我们观察到,乙二醇诱导大鼠草酸钙肾结石的形成伴随着内质网应激和自噬的过度激活。CQ处理可有效抑制自噬的过度激活,进而减轻乙二醇诱导的大鼠肾脏损伤和细胞凋亡;4-PBA处理能同时抑制内质网应激和自噬的激活,且表现出与CQ相似的肾保护作用,显著降低CRE和BUN的含量、NGAL和Kim-1的排泄量、和肾内晶体沉积,减轻乙二醇诱导的大鼠肾脏损伤和细胞凋亡。此外,4-PBA的自噬抑制作用伴随着PERK/eIF2α信号通路的低表达。结论:1.乙二醇诱导大鼠草酸钙肾结石的形成伴随着内质网应激和自噬的过度激活。2.乙二醇诱导大鼠肾脏内质网应激的过度激活,进而可以通过内质网应激介导自噬的激活,促进肾内晶体的形成和组织的损伤。3.应用内质网应激抑制剂4-PBA和自噬抑制剂CQ能够有效地调节乙二醇诱导的大鼠草酸钙肾结石模型中肾脏内的内质网应激和自噬水平。4.内质网应激可通过PERK-eIF2α途径介导自噬的激活,抑制ERS介导的过度自噬可有效保护肾功能,减少肾小管上皮细胞凋亡和肾结石的形成。