EZH2对胃癌细胞增殖、迁移和凋亡的作用及机制研究

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目的:验证EZH2在胃癌细胞中的异常表达,观察EZH2对胃癌细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响,并通过生信分析手段初步筛选EZH2的上游分子机制。方法:1.运用实时荧光定量PCR和WB技术,比较EZH2在正常胃上皮细胞(GES-1)与胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901和MKN28)中的表达量。2.运用小干扰RNA沉默EZH2,用实时荧光定量PCR和WB技术验证小干扰RNA沉默效果。通过CCK-8法、划痕实验和流式细胞术探讨EZH2对胃癌细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。3.在数据库ENCORI和Target Scan中查询EZH2的上游miRNA,应用韦恩图工具对查询结果进行交集。对miRN A与靶基因EZH2的结合程度进行热力学稳定性分析。4.同时沉默 EZH2 后,运用实时荧光定量 PCR技术检测胃癌细胞中miRNA表达量的变化。运用实时荧光定量PCR技术,比较miRNA在GES-1与MGC-803、SGC-7901和MKN28细胞中的表达量。5.通过数据库 ENCORI 和 DAINA 中查询 hsa-miR-450b-5p 对应的lnc RNA,应用韦恩图工具对查询结果进行交集,并对hsa-miR-450b-5p与lncRN A的结合程度进行热力学稳定性分析。运用实时荧光定量PC R技术,比较 lncRNA NEAT1 在 GES-1 与 MGC-803、SGC-7901 和 MKN28细胞中的表达量。6.用miRN A mimic转染细胞,检测过表达hsa-miR-450b-5p后,胃癌细胞中lncRNA NEAT1和EZH2表达量的变化。7.同时,运用实时荧光定量PCR技术检测沉默lnc RNA NEAT1后,检测hsa-miR-450b-5p和EZH2表达量的变化。结果:1.相较于 GES-1,EZH2 在胃癌细胞 MGC-803、SGC-7901 和 MKN-28 中的表达量均有所增高,在基因水平分别增高了 12.522倍、6.065倍和5.695倍(P<0.05);在蛋白水平分别增高了 2.71倍、2.27倍、1.92倍(P<0.05)。2.针对EZH2设计了三个小干扰RNA,在基因水平,在胃癌细胞MGC-803中siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3均有沉默效果(P<0.05);在胃癌细胞 SGC-7901 中 siRNA-1 未达到沉默效果(P>0.05),siRNA-2(P>0.05)和siRNA-3(P<0.05)有沉默效果。其中,综合两种细胞胃癌细胞中,siRNA-3 的沉默效果最好。在蛋白水平上,siRNA-3在两种胃癌细胞中均有沉默效果。沉默EZH2后,在细胞增殖实验中,MGC-803细胞活力24h和48h时均有所减弱(P<0.05),SGC-7901细胞24h时细胞活力没有明显变化(P>0.05),48h时细胞活力减弱(P<0.05);在细胞迁移实验中,在胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中细胞迁移能力均有所减弱(P<0.05);在细胞凋亡实验中,在胃癌细胞 MGC-803 和SGC-7901中细胞凋亡率均未发生明显变化(P>0.05)。3.ENCORI、miRDB和Target Scan数据库分别查询EZH2对应miRNA,并用韦恩图工具进行交集得到1 8个miRN A;使用miRanda分析软件对1 8个miRNA与EZH2的位点结合程度进行分析,通过“Score值”筛选出来分值较高的 hsa-miR-1301-3p、hsa-miR-4465、hsa-miR-5047、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-450b-5p。4.在胃癌细胞 MGC-803 中,沉默 EZH2 后 hsa-miR-1301-3p、hsa-miR-4465、hsa-miR-5047、hsa-miR-144-3p 和 hsa-miR-450b-5p 的表达量均有所增高,但hsa-miR-5047、hsa-miR-144-3p的结果不具有统计学意义(P>0.05);在胃癌细胞 SGC-7901 中,沉默 EZH2 后hsa-miR-1301-3p、hsa-miR-4465、hsa-miR-5047 和 hsa-miR-450b-5p的表达量均有所增高(P<0.05),hsa-miR-144-3p的表达量没有增高(P>0.05)。相较于 GES-1,hsa-miR-1301-3p 在胃癌细胞 MGC-803、SGC-7901中低表达(P<0.05),在MKN-28中没有低表达(P<0.05);hsa-miR-4465 在三种胃癌细胞中的表达量与 GES-1 没有差别(P>0.05);hsa-miR-450b-5p在三种胃癌细胞中均低表达(P<0.05)。5.通过数据库ENCORI和DAINA分别来查询 hsa-miR-450b-5p对应的lnc RNA,并用韦恩图工具进行交集得到2个lnc RNA;使用miRanda分析软件对2个lncRNA与hsa-miR-450b-5p的位点结合程度进行分析,通过“Score值”筛选出来分值最高的 lncRNA NEAT1。lncRNA NEAT1在胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和MKN-28中的表达量相较于GES-1分别增高了约6.876倍、16.786倍和1 1.893倍(P<0.05)。6.针对 hsa-miR-450b-5p 设计了 mimic,在胃癌细胞 MGC-803 和SGC-7901 中转染 mimic 后 hsa-miR-450b-5p 的表达量分别增高了14.153 倍和 906.589 倍(P<0.05)。过表达 hsa-miR-450b-5p 后,在基因和蛋白水平,MGC-803和SGC-7901中EZH2的表达量均随之降低(P<0.05)。过表达 hsa-miR-450b-5p 后,MGC-803 和 SGC-7901 中lncRNA NEAT1的表达量也随之降低(P<0.05)。7.针对lncRNA NEAT1设计了三个小干扰RNA,在胃癌细胞MGC-803中siRNA-1和siRNA-2均有沉默效果(P<0.05),siRNA-3未达到沉默效果(P>0.05);在胃癌细胞 SGC-7901 中 siRNA-1、siRNA-2 和 siRNA-3均有沉默效果(P<0.05)。综合两种细胞,siRNA-2沉默效果最好。沉默 lnc RNA NEAT1 后,胃癌细胞 MGC-803 和 SGC-7901 中 EZH2 的表达量均随之降低(P<0.05),hsa-miR-450b-5p在胃癌细胞MGC-803中的表达量没有发生明显的变化(P>0.05),在 SGC-7901 中hsa-miR-450b-5p的表达量随之增高(P<0.05)。结论:1.EZH2在胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和MKN-28中高表达。2.在胃癌细胞 MGC-803 和 SGC-7901 中 hsa-miR-450b-5p 与 EZH2 和lncRNA NEAT1 的表达呈负相关;同时,lncRNA NEAT1与胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中EZH2的表达正相关。3.EZH2促进胃癌细胞增殖和迁移,但是对胃癌细胞的凋亡无影响。
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