论文部分内容阅读
第一部分目的研究雄激素受体(androgen receptor, AR)表达在不同雌激素受体(estrogen receptor, ER)状态乳腺癌中与各临床病理特征间的关系及预后,探讨雄激素受体在乳腺癌内分泌治疗中的指导作用。方法从ER和PR阳性的乳腺浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)病例中随机选取111例为ER+组,从ER和PR阴性病例中随机选取113例为ER-组,共224例。采用免疫组化方法检测AR、HER2、Ki67、p53中的表达,依据AR结果将ER+组再分为ER+AR+和ER+AR-两个亚组,将ER-组再分为ER-AR+和ER-AR-两个亚组,结合临床病理资料进行组间比较分析和预后分析。结果1.AR在浸润性导管癌中的阳性表达率为67.9%,在ER+组和ER-组分别为80.2%、55.8%,两组差异有显著性(P=0.002)；AR与ER蛋白表达(P<0.001)差异有统计学意义。AR阳性者体积小(P=0.007),组织学分级低(P=0.001),病理分期低(P=0.004),AR状态与Ki67、患者年龄、淋巴结转移无相关性(P>0.05)。虽然AR的表达与绝经状态差异没有统计学意义(P>0.05),但是在绝经后乳腺癌病例中,AR的表达率(73.3%)高于绝经前病例(62.0%)。2.在ER+组,AR阳性表达与肿瘤大小(P=0.015),组织学分级(P=0.033),分期(P=0.002),淋巴结转移(P=0.001),接受内分泌治疗情况(P=0.007)相关,与其它临床病理特征差异无显著性(P>0.05)。3.在ER-组,AR阳性表达者组织学分级低(P=0.039),其中组织学Ⅱ级者所占的百分比较高；AR表达与HER-2过表达(P=0.039)和绝经状态(P=0.016)相关；AR表达与Ki67无相关性(P=0.157),但在Ki67高表达者中AR的阳性表达率有降低趋势。4.Kaplan-Meier生存分析显示AR表达与无瘤生存有明显相关性(P<0.001),在ER+组和ER-组,AR阳性者均具有较好的预后(P<0.001,P=0.046)。对224例患者和ER+组患者分别进行COX多因素分析,结果显示AR状态是影响无瘤生存的独立因素的独立因素(95%置信区间,040-0.054,P=0.003；95%置信区间,0.03-0.512,P=0.004)。结论在不同激素状态乳腺癌中检测AR表达可作为有意义的指标来估测预后、为选择性指导临床内分泌治疗和个体化治疗提供理论依据。除了ER、PR、HER2在乳腺癌中表达,AR蛋白也应成为乳腺癌常规检测项目之一,在ER阴性乳腺癌发病机理和个体化激素治疗的研究中具有较为重要的价值。AR可以作为指导临床内分泌治疗新的靶标,为不同ER状态乳腺癌激素治疗提供依据。第二部分目的研究雄激素受体(androgen receptor, AR)与：microRNA-let7a(miR-let-7a)之间的相互作用,AR活化后miR-let-7a及其下游靶基因对ER+AR+的乳腺癌MCF7细胞系增殖的影响。方法本研究选择雌激素受体(estrogen receptor, ER)阳性乳腺癌细胞系,体外培养,用实时定量PCR(real timePCR, RT-PCR)验证miR-let-7a在雄激素二氢睾酮(5alpha-dihydrotestosterone, DHT)组表达明显上调。通过向MCF7细胞系中转染miR-let-7a高表达或低表达载体,应用MTT检测miR-let-7a对乳腺癌MCF7细胞生长增殖的影响；并应用流式细胞术检测转染miR-let-7a前后乳腺癌细胞周期的变化。应用Western blot的方法验证转染miR-let-7a前后,其下游靶蛋白ER-α、 c-Myc、k-ras表达的变化。本研究初步探讨AR和let-7之间的相互作用以及AR/miR-let-7a下游靶基因的表达对抑制ER+AR+乳腺癌MCF7细胞生增殖的影响。结果1.实时定量PCR显示10-8mol/L雄激素刺激后,miR-let-7a mRNA水平表达是明显上调的。提示AR活化信号可调节miR-let-7a的表达。2.MTT显示miR-let-7a对MCF7细胞的生长具有明显的抑制作用,抑制率呈时间相关性,即随着时间的延长细胞生长抑制率呈逐渐增高趋势,miR-let-7a对MCF7细胞的抑制作用高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与对照组相比,miR-let-7a转染组MCF7细胞中G1期细胞比例增高(73.59%),S期细胞比例明显降低(18.58%)；对照组G1期65.98%,S期27.65%。miR-let-7a antisense oligonucleotides (ASOs)转染组MCF7细胞中G1期细胞比例降低64.87%,S期细胞比例明显增高28.37%,对照组G1期72.42%,S期20.55%。提示miR-let-7a可能将MCF7细胞阻滞于G1期,miR-let-7a可能抑制细胞自G1期向S期转化。3.未转染miR let-7a的乳腺癌MCF-7细胞中Western blot分析结果显示DHT处理组c-Myc、k-ras蛋白表达减少,而DHT处理前后内参GAPDH的条带亮度几乎无差异。miR let-7a过表达时,ER-α、c-Myc、k-ras各蛋白的表达与对照组相比明显降低,AR蛋白表达没有明显变化；相反,转染miR let-7a抑制剂的MCF7细胞系中,ER-α、c-Myc、k-ras蛋白表达则增高,AR表达也有所增加。结论1.雄激素是通过与其相应的AR受体结合来发挥其生物学效应的,研究显示AR活化信号可以明显上调miR-let-7a的表达。miR-let-7a可以抑制乳腺癌MCF7细胞系的增殖,并使细胞周期阻滞于G1/S期。与AR活化相关的miR let-7a为乳腺癌的靶向治疗提供了新的靶点。2. miR let-7a是一个抑癌基因,在ER+的MCF7细胞系中,抑制MCF7细胞增殖,其机制可能与负调控靶基因c-Myc、k-ras的表达相关,同时作用细胞周期蛋白调控细胞分化,从而抑制肿瘤的发生发展。miR-let-7a可通过负调控ER-α的活性,抑制细胞的增殖,触发凋亡